Un ruolo per la glia nella progressione della Sindrome di Rett

Da tempo sappiamo che la proteina MeCP2 è espressa nei neuroni e che la sua assenza gioca un ruolo nell’insorgenza della Sindrome di Rett. Più recentemente esperimenti in vivo ed in vitro (Ballas 2009, Maezawa 2009) hanno dimostrato che MeCP2 viene espressa anche in tutti i tipi cellulari della glia di cervelli sani. Le cellule della glia sono di diversi tipi (astrociti, microglia…) e sono abbondanti nel cervello, hanno una grande importanza per i neuroni, in quanto sono coinvolte nel mantenimento di struttura e funzione del neurone.

Gli studi riportati qui in dettaglio hanno lo scopo di chiarire il ruolo di questa componente cellulare nella sindrome di Rett. Cellule della glia prive di Mecp2 non consentono a neuroni wild type (che esprimono normalmente Mecp2) di avere una struttura corretta e di funzionare efficientemente.

Ciò che è interessante è il fatto che le cellule della glia agiscono sui neuroni producendo sostanze che interagiscono con i neuroni stessi, un deficit o un eccesso di queste sostanze sembrerebbe avere un ruolo importante nel danneggiare il neurone e nell’evoluzione della malattia.

 

Dott.ssa Silvia Russo, Istituto Auxologico, Milano

La sindrome di Rett è una malattia del neurosviluppo causata dalle mutazioni nel gene MECP2, methyl CpG-binding protein 2.

La malattia colpisce quasi esclusivamente le bambine ed i primi sintomi compaiono di norma tra i 6 ed i 18 mesi di vita. A tale età le bambine iniziano una fase di regressione, perdono la parola, il controllo e l’uso funzionale delle mani, che si accompagnano spesso a microcefalia ritardo mentale, autismo, grave stress, epilessia e ad un globale ritardo della crescita.

La funzione più nota della proteina MeCP2 è quella di regolatore trascrizionale, ossia regola il funzionamento di molti altri geni con un ruolo importante nel cervello dove appare presente in maggiore abbondanza, ma sono state inoltre dimostrate anche altre funzioni, tra cui importante quella di regolatore dello splicing. Seppure è chiaro che l’assenza delle complesse funzioni svolte da MeCP2 è causativa della sindrome di Rett, la relazione tra la sintomatologia e le basi biologiche ha ancora molti punti oscuri.

La ricerca si avvale di studi in vitro, con colture di cellule ed in vivo con modelli di topi, ben rappresentativi del quadro clinico della malattia; nei modelli murini il gene viene rimosso (modelli ko) oppure è mutato corrispondenti a fenotipi clinici diversi. Il gene bersaglio, in questo caso Mecp2, può essere assente in tutte le cellule del topo ma si creano dei modelli in cui solo in alcuni specifici tessuti o cellule il gene non funziona; a volte è possibile anche controllare il momento dello sviluppo in cui il gene smette di funzionare.

Esperimenti in vivo ed in vitro hanno dimostrato come l’assenza di MeCP2 determini anomalie nella struttura del neurone: le arborizzazioni dei dendriti (i dendriti sono delle ramificazioni presenti in ciascun neurone che ne permette la comunicazione con altri neuroni) sono più povere, minore è la densità delle spine, la trasmissione basale sinaptica e la plasticità eccitatoria delle sinapsi, ridotta è l’attività corticale spontanea.

Inizialmente si pensava che la proteina MECP2 fosse espressa prevalentemente nei neuroni, tuttavia successivi esperimenti in vivo ed in vitro (Ballas 2009, Maezawa 2009) dimostrarono per la prima volta che la proteina MeCP2 viene espressa anche in tutti i tipi cellulari della glia di cervelli sani e che MeCP2 espresso dalla glia è importante per la normale morfologia del neurone. La glia comprende diversi tipi cellulari, astrociti, oligodendrociti e microglia. In particolare gli astrociti rappresentano un’ampia popolazione di cellule non neuronali del cervello (sono la più numerosa componente cellulare del sistema nervoso centrale) ed hanno ruoli funzionali e strutturali importanti per i neuroni in quanto sono coinvolti nella formazione della sinapsi, nella plasticità neuronale e nella prevenzione della esocitotossicità neuronale, grazie all’attività di rimozione del glutammato in eccesso attraverso i trasportatori del glutammato.

I livelli di proteina MeCP2 presente nei neuroni rispetto agli astrociti sono variabili nei diversi tipi di neuroni: paragonabili nei neuroni dei granuli cerebellari e molto più alti nei neuroni cerebellari e nella glia. Gli esperimenti dimostravano l’espressione di MeCP2 sia nella glia embrionale sia in tutti i tipi cellulari di glia nel cervello adulto.

Ruolo degli astrociti – (Da Ballas et. 2009 Effetto non cellulare delle cellule della glia deficitarie di MeCP2 sulla morfologia dei dendriti dei neuroni).

Ballas nel 2009 ha mostrato che il medium di coltura derivato da colture di astrociti di un topo maschio privo di Mecp2 non erano in grado di supportare la normale crescita in neuroni normali, senza difetto di MeCP2. Allo stesso modo è stato visto che i neuroni che portavano la mutazione di MECP2 nel medium di astrociti normali mostravano una morfologia normale dei dendriti. Ciò suggeriva che nelle pazienti Rett femmine, mosaici naturali per la mutazione (possiedono un gene MECP2 normale ed uno mutato), i neuroni normali potrebbero essere influenzati dalla presenza di astrociti privi di MECP2. è possibile come accade in alcune malattie neurodegenerative che le cellule della glia mutate siano prive di una molecola essenziale per mantenere la corretta struttura dei neuroni oppure che secernano un fattore solubile che è dannoso per i neuroni. Gli autori suggeriscono che la mancanza di fattori neurotrofici come il fattore neurotrofico derivato dalle linee cellulari della glia, GDNF, che influenza la ramificazione dei dendriti, oppure molecole secrete dalla glia come il fattore tumorale della necrosi alfa TNF-. il monossido di azoto, NO, possono determinare una struttura aberrante nel neurone e la perdita delle funzioni neuronali. Ricercando candidati che potessero alterare i livelli di queste molecole si è evidenziata la presenza di un’aminotransferasi presente in concentrazione tripla negli astrociti privi di Mecp2 rispetto a quelli normali. L’enzima è coinvolto nella sintesi del glutammato e può modularne la risorsa. In questo caso, l’identificazione di fattori/e secreti in modo aberrante potrebbero suggerire uno strumento per l’intervento farmacologico nella sindrome di Rett.

Ruolo della microglia (da Maezawa et al 2010, la microglia della sindrome di Rett danneggia dendriti e sinapsi mediante un elevato rilascio di glutammato).

Studi pubblicati nel 2010 da Maezawa evidenziano una potente attività neurotossica nel medium di coltura ottenuto dalle cellule della microglia (un componente della glia diverso dagli astrociti) del topo Mecp2 null di Bird. I neuroni cresciuti in queste condizioni mostravano una morfologia anomala dei dendriti, segni della distruzione dei microtubuli e danno dei componenti postsinaptici glutamatergici entro 24 ore. Il fattore tossico identificato da questo gruppo è il glutammato, prodotto in maggiori quantità nelle cellule della microglia Mecp2 null. L’aumento del glutammato deriverebbe in parte da una maggiore produzione di glutaminasi (enzima che trasforma la glutammina in glutammato) e di connessina 32, molecola responsabile del rilascio del glutammato. In via sperimentale si osserva che sia il blocco della sintesi del glutammato mediato da inibitori della glutaminasi, sia l’uso di antagonisti dei recettori del glutammato bloccavano la neurotossicità di queste cellule. Il fatto che la tossicità non si manifestasse conducendo gli esperimenti in colture pure di neuroni derivati dagli astrociti (e non dalla microglia) suggerirebbe che la microglia influenzi l’insorgenza e la progressione della Rett e che la sintesi del glutammato piuttosto che il suo rilascio potrebbero essere un target terapeutico per la Rett.

Lioy DT et, Nature 2011

In questo studio gli autori dimostrano che in modelli di topo privi in tutte le cellule del gene MeCP2, la riattivazione preferenziale di Mecp2 negli astrociti determina un miglioramento significativo dei livelli di ansietà e movimento, riporta i pattern respiratori alla normalità e prolunga la sopravvivenza. Inoltre, la riattivazione di Mecp2 nelle cellule mutanti degli astrociti esercita un effetto positivo non dipendente dall’attività cellulare, in vivo sui neuroni mutanti, ripristinando la normale morfologia dei dendriti ed aumentando i livelli del trasportatore eccitatorio del glutammato VGLUT1.

Un precedente studio (Guy et al, 2007) ha dimostrato come la riattivazione di Mecp2 in tutte le cellule di un modello murino disegnato ad hoc consenta una normale durata della vita, il recupero delle abilità motorie e un generale miglioramento della salute. Poichè era stato osservato che l’espressione di Mecp2 nelle prime fasi dello sviluppo previene la comparsa di molti sintomi Rett-like, le cellule neuronali sono probabilmente un componente cruciale del recupero.

Tuttavia, in seguito alle recenti scoperte sul coinvolgimento della glia nella sindrome di Rett, il gruppo di Mandel si è proposto di valutare con esperimenti in vivo l’eventuale ruolo svolto dagli astrociti nella remissione della neuropatologia. A questo scopo sono stati incrociati due modelli di topo in modo da ottenere un topo che fosse in grado riattivare il gene Mecp2 in presenza di tamoxifene, ma solo negli astrociti e non nei neuroni, Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 (VEDERE LA LEGENDA). Nei neuroni si osservava solo una percentuale molto bassa (<5%) di excisione, che non aumentava con l’età e con una riattivazione di Mecp2 limitata al cervello; non si osservava nessuna espressione in eccesso di Mecp2 negli astrociti riattivati. Per escludere la possibilità che questa piccola quota di neuroni aggiunti al basso livello costitutivo di Mecp2 potesse alterare la variazioni comportamentali che avrebbero dovuto quantificare, hanno opportunamente modificato uno dei ceppi parentali riducendone l’espressione.

Gli autori hanno preso in considerazione i principali aspetti clinici della malattia studiabili nei modelli murini confrontando il modello di Guy dove Mecp2 non viene inizialmente espresso, ma può essere ripristinato in tutte le cellule ed il nuovo modello dove il ripristino avviene solo negli astrociti.

La durata media di vita del ceppo Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 trattato con solo olio (controllo) era di 3 mesi, maggiore rispetto al normale KO probabilmente per un’attività residua dell’allele con la cassetta di STOP. Al contrario 9/11 topi trattati con tamoxifene erano vivi dopo 7 mesi, 7/9 venivano sacrificati per studi ulteriori. Il topino più longevo era stato sacrificato a 15 mesi. I topi avevano anche maggiori dimensioni, circa il 20%. Valutandoli con un punteggio descritto per studi osservazionali, lo stato generale di salute dei TAM Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 (topi trattati con tamoxifene) appariva stabilizzato e non peggiorato come appariva nei topi trattati con olio. I topi privi di Mecp2 sono ipoattivi e mostrano misure del comportamento alterate dovute all’ansietà. Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 trattati con olio percorrevano in gabbia e in spazi aperti il 20% della distanza con il 20% della velocità rispetto al topo parentale hGFAPcreT2, mentre il topino trattato con TAM che esprime Mecp2 negli astrociti si muove al 50%. Analoghi miglioramenti erano stati osservati anche nelle misure dell’ansietà. I risultati erano gli stessi per tutti i genotipi.

Le pazienti Rett ed i modelli murini hanno una respirazione alterata. Infatti a partire dalla 12 settimana Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 mostrava livelli di apnea molto più severi del controllo, ma due mesi dopo il trattamento TAM il pattern respiratorio di 10/12 topi Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 acquisivano un respiro regolare, in 2 di questi la respirazione rimaneva normale per 5 mesi, in 2/3 i valori erano normali, mentre la frequenza delle apnee nel terzo topino era ridotta ma non ritornata a livello del controllo. Il miglioramento nella respirazione era spiegabile dalla riattivazione di Mecp2 negli astrociti all’interno del complesso pre-Botzinger, un’area cerebrale implicata nel controllo del ritmo respiratorio e nei difetti respiratori della sindrome di Rett. è importante osservare che il topo Mecp2Stop/y quando trattato con TAM non migliorava la respirazione irregolare, né diminuiva le apnee, mentre il topo Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 (maschi e femmine) sviluppava un numero significativo di apnee a partire da 4-6 mesi, non migliorava se trattato con olio mentre veniva corretto dal trattamento con TAM anche nel topo affetto più severamente.

Gli autori hanno preso in considerazione la morfologia del neurone che nei cervelli delle bambine RTT e dei topi modello hanno ridotte dimensioni del corpo neuronale e ridotta complessità dendritica in alcune regioni. A 3,5 mesi nei topi TAM Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 la dimensione del corpo somatico dei neuroni dell’ippocampo, del cervelletto e della corteccia era ancora più piccola rispetto ai controlli hGFAPcreT2 e dopo 7 mesi era ritornata normale solo nelle regioni del cervello che mostravano una riattivazione dell’espressione negli astrociti di Mecp2. Considerando la complessità dei dendriti Mecp2Stop/y e Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 trattato con olio avevano il 25% in meno di ramificazioni ma tornavano normali dopo 3,5 mesi nei neuroni di Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 trattati con TAM. I neuroni privi di Mecp2 mostravano anche un deficit nelle proteine necessarie alla neurotrasmissione eccitatoria come il trasportatore eccitatorio del glutammato VGLUT1; in questo caso si osservava una riduzione del 20% nei modelli patologici che veniva ripristinata alla normalità nel c–hGFAPcreT2 a 3-4 mesi dal trattamento TAM.

Nell’insieme questi dati indicano come la re-espressione di Mecp2 negli astrociti è in grado di influenzare positivamente i vari componenti della neurotrasmissione in vivo, con modalità che non dipendono dalla cellula in sé, ma dalla produzione di molecole che interagiscano con i neuroni.

Per validare questi dati era necessario provare a rovesciare la questione verificando le conseguenze dell’assenza di Mecp2 nei soli astrociti. A tale proposito è stato incrociato il modello di topo con Mecp2 difettivo, Mecp2Flox/y con il modello hGFAPcreT2 per ottenere un modello Mecp2Flox/y hGFAPcreT2 che produce Mecp2 nei neuroni, ma non negli astrociti: questo modello condivide con il topino Rett alcune caratteristiche, quali la minore dimensione del corpo neuronale, la posizione degli arti posteriori, la respirazione irregolare, mentre la durata della vita, il movimento, i comportamenti derivanti dall’ansietà erano nella norma. Inoltre il numero di ramificazioni apicali dendritiche nei neuroni dell’ippocampo non era alterata, ad indicare che la perdita di Mecp2 dal 21° giorno dopo la nascita non determina la distruzione di un circuito neuronale dell’ippocampo correttamente allestito. La presenza di Mecp2 negli astrociti sembra invece molto importante per il pattern della respirazione. Quindi le interazioni tra glia e neuroni che sottendono respirazione e circuiti dell’ippocampo sono differenti.

 

Considerazioni finali degli autori

I nostri studi dimostrano il coinvolgimento di neuroni e glia nell’insorgenza della malattia. Nella sclerosi laterale amiotrofica familiare, i neuroni e la glia hanno diversi ruoli nell’andamento della malattia: i primi coinvolti nelle prime fasi e gli astrociti nella progressione. I nostri dati sono compatibili con questo modello, perchè rimuovendo solo negli astrociti Mecp2 dal 21° giorno dopo la nascita si ottiene un fenotipo più lieve e la re-espressione nei soli astrociti stabilizza i sintomi.

Questo studio non chiarisce se entrambi i tipi cellulari, neuroni e glia, privi di MeCP2 siano la causa della malattia oppure altri tipi di cellule delle glia potrebbero essere coinvolte nel processo della malattia.

Sebbene il danno neuronale sia alla base del funzionamento deficitario del sistema nervoso nella Rett, la riattivazione di Mecp2 nella glia può migliorare nei modelli murini 4 importanti aspetti: la morte prematura, la respirazione aberrante, l’ipoattività e la diminuzione della complessità dendritica. Studi futuri volti all’identificazione di molecole chiave che sono rimpiazzate dopo la re-espressione di Mecp2 nella glia possono fornire indizi circa i meccanismi di recupero indicando nuovi potenziali target per l’intervento terapeutico.

 

LEGENDA

Mecp2Stop/y indica il topo maschio creato da Bird, in grado di esprimere alla nascita la sindrome di Rett, ma successivamente alla riattivazione del gene recupera molti deficit. In questo topo MeCP2 è assente in tutte le cellule.

hGFAPcreT2 è una linea che consente di indurre una ricombinazione specifica di geni specifici per le cellule della glia e rappresenta un controllo sano che esprime Mecp2 normalmente.

Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 deriva dall’incrocio dei precedenti, per cui nasce ammalato e recupera la funzionalità di MeCP2 solo nelle cellule della glia, GAFAP è un marcatore dell’espressione degli astrociti.

Nel lavoro si confrontano

  • topi trattati con olio, dove il gene Mecp2 non si riaccende e
  • topi trattati con tamoxifene (un antibiotico) TAM Mecp2Stop/y–hGFAPcreT2 o TAM Mecp2Stop/y in cui si rimuove il segnale di stop e il gene ricomincia a funzionare.

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