Metallotioneine: potenziali marker di stress ossidativo nella Sindrome di Rett

Laura Vergani1, Maria Pintaudi2

1 Sezione di Fisiologia, Dipartimento di Scienze della Terra, dell’Ambiente e della Vita, Università degli Studi di Genova

2 Università degli Studi di Genova, DINOGMI. U.O Neuropsichiatria infantile, Genova

 

Introduzione

Viene presentata la conclusione dello studio sulle metallotioneine nella Sindrome di Rett i cui risultati preliminari erano stati anticipati nel precedente convegno.

La Sindrome di Rett, come è noto, è caratterizzata da una discreta eterogeneità del quadro clinico, in termini di gravità, età di comparsa e regressione dei sintomi. Tale variabilità è stata ipotizzata essere associata al tipo di gene e di mutazione, ma tale correlazione mostra ancora punti controversi [Scala et al. 2007; Bebbington et al. 2008]. Pertanto è stato ipotizzato che differenze a livello di altri parametri, quali lo stress ossidativo, intervengano nel modulare la gravità della patologia [De Felice et al. 2012]. Lo stress ossidativo è una condizione patologica causata dalla rottura dell’equilibrio fisiologico fra produzione/eliminazione di specie chimiche ossidanti. Tra i più comuni ossidanti ricordiamo i radicali liberi, ossia molecole/atomi estremamente reattivi che innescano reazioni a catena danneggiando le strutture cellulari, e le specie reattive dell’ossigeno (ROS). Gli organismi presentano due classi di sistemi di difesa dagli agenti ossidanti:

(i) gli antiossidanti enzimatici (Superossido Dismutasi-SOD, catalasi-CAT, Glutatione Perossidasi-GPx);

(ii) gli antiossidanti non-enzimatici quali glutatione (GSH) e metallotioneine (MT).

È noto che il sistema nervoso è estremamente sensibile agli agenti ossidanti a causa dell’elevato consumo di ossigeno, dei bassi livelli di antiossidanti enzimatici e dell’alta concentrazione di acidi grassi polinsaturi (PUFA) nelle membrane dei neuroni.

Negli ultimi anni, vari lavori hanno evidenziato come una condizione di stress ossidativo caratterizzi la sindrome di Rett [Sierra et al., 2001, Battisti et al., 2004, De Felice et al., 2009]. In particolare, a livello ematico si sono valutati l’attività di alcuni enzimi antiossidanti (SOD, catalasi) [Sierra et al., 2001], il livello di perossidazione lipidica e di marker di stress ossidativo [De Felice 2011] nei pazienti RTT rispetto al gruppo di controllo (soggetti normali sani).

A tale riguardo, la nostra ipotesi è che le metallotioneine, che rappresentano il principale meccanismo antiossidante non enzimatico a livello cellulare insieme al GSH, possano essere un marker accurato e sensibile della condizione di stress ossidativo ematico associato alla sindrome di Rett. Le MT sono proteine a basso peso molecolare (6-7 kDa), caratterizzate da un’alta affinità per i metalli [Coyle et al., 2002]. Sono pressoché ubiquitarie negli organismi e ben conservate attraverso la scala evolutiva, a riprova della loro importanza nei processi biologici [Vergani in ‘‘Metallothioneins and Related Chelators’’, 2009]. La funzione primaria svolta dalle MT è quella di deposito/distributore di zinco all’interno della cellula e dell’organismo in generale, di protezione da metalli pesanti [Vergani et al. 2007], ma agiscono anche nella difesa dei tessuti dal danno ossidativo [Lanza et al. 2009; Vergani et al 2005]. Nell’uomo sono state identificate al momento 17 isoforme, e quelle maggiormente espresse nella maggioranza dei tipi cellulari sono MT-1A, MT-1E e MT-2A. Studi recenti hanno mostrato come le MT siano coinvolte in diverse malattie del sistema nervoso centrale, ad esempio in patologie neurodegenerative quali morbo di Alzheimer, morbo di Parkinson, Sclerosi Multipla e Sclerosi Laterale Amiotrofica [Lanza et al., 2009; Penkowa et al.; 2009; Vergani et al., 2011; Uccelli et al. 2012; Giunti et al. 2012].

Alla luce dello sbilanciamento ossidativo osservato nelle pazienti RTT, rilevabile anche a livello del sangue periferico, il nostro studio ha analizzato l’espressione di tre principali isoforme di MT e l’eventuale correlazione con la condizione di stress ossidativo ematico in una coorte di 27 bambine RTT rispetto a bambine sane omogenee per età e numero.

Materiali e Metodi

Lo studio ha coinvolto due gruppi sperimentali:

(i) 27 bambine RTT di età <12 anni (età media 6.8±2.9 anni);

(ii) 27 bambine di controllo di età omogenea (età media 6.7±3.2 anni).

Tutte le pazienti reclutate nello studio presentano mutazioni nel gene MECP2 e sono state arruolate dall’Unità di Neuropsichiatria Infantile dell’Istituto G. Gaslini di Genova, dal Centro Epilessia dell’Ospedale San Paolo di Milano, dal Centro Malattie Metaboliche Rare del Policlinico di Catania e dall’ambulatorio di Genetica Medica dell’Istituto Auxologico Italiano di Milano, dove è stata anche effettuata la diagnosi molecolare delle pazienti.

La diagnosi di Sindrome di Rett è stata formulata in base ai New Rett Diagnostic Criteria (Neul et al. 2010).

Tutte le pazienti hanno effettuato valutazioni cliniche – neurologiche e per ciascun soggetto è stato identificato il fenotipo clinico, il genotipo e un punteggio di gravità in base alle scale Kerr (Kerr et al. 2001) e al CSS – Clinical Severity Score (Neul et al 2008).

La scala Kerr prevede la valutazione di 20 parametri caratteristici della Sindrome: circonferenza cranica, sviluppo psicomotorio, peso e altezza, tono muscolare, postura colonna vertebrale, contratture articolari, funzionalità motoria, stereotipie manuali, movimenti involontari, utilizzo delle mani, difficoltà oro-motorie, deficit intellettivo, linguaggio, epilessia, ritmo respiratorio da svegli, circolazione periferica, disturbi dell’umore, disturbi del sonno. Il punteggio varia per tutti gli item da 0 a 2.

Il CSS, invece, prende in considerazione 13 parametri: età di inzio della regressione, crescita somatica, crescita della circonferenza cranica, postura seduta, deambulazione, utilizzo delle mani, scoliosi, linguaggio, comunicazione non verbale, disfunzioni respiratorie, sintomi autonomici, esordio delle stereotipie e di crisi epilettiche. Il punteggio di ogni item può variare da 0-4/0-5 (0: meno grave).

Campioni di sangue (2-5 ml) sono stati prelevati dalle bambine e sono stati raccolti in tubi contenenti appropriati anticoagulanti, sono stati processati tramite centrifugazione su gradiente Ficoll-Hypaque (Histopaque®-1077) per separare le diverse frazioni: plasma, eritrociti (RBC) e globuli bianchi (WBC).

Un’altra parte dello studio, condotto dalla dott.ssa Russo dell’Istituto Auxologico di Milano ha valutato la correlazione fra lo stress ossidativo e il profilo di metilazione genica: MeCP2 lega il DNA metilato e una ipo-metilazione del genoma insieme al deficit di MeCP2 potrebbe alterare espressione genica nelle bambine RTT.

Campioni analizzati:

bambine RETT (n=8) della coorte reclutata nello studio;

controlli pediatrici di età <12 anni (n=15);

controlli adulti di età >25 anni (n=112).

A livello di ogni singola CpG è stato effettuato un confronto fra ogni paziente Rett vs un controllo adulto (numericamente grande) e un controllo pediatrico (numericamente piccolo) per individuare loci genici con CpG epimutate (iper- e ipo-metilate).

Elaborazione dati e analisi statistica: l’analisi statistica dei dati è stata effettuata utilizzando il tramite test non parametrico di Wilcoxon-Mann-Whitney.

 

Risultati

Le pazienti Rett presentavano in 19 casi una forma classica, in 2 una forma variante a linguaggio conservato, in 5 una forma congenita e in un caso una forma frusta.

Le mutazioni Mecp2 sono state classificate in: troncanti precoci (perdita del dominio TRD e/o MBD); troncanti tardive (perdita della regione C-terminale) e missenso.

In Figura 1A e B viene riportato lo score clinico medio (± SD) valutato tramite la scala di Kerr per i gruppi di mutazioni analizzate.

 

figura-1aFigura 1A

figura-1b
Figura 1B

Si osserva che, come noto, le mutazioni precoci sono associate ad un decorso clinico più severo, rispetto alle tardive ed alle missenso.

La misura dello stress ossidativo ematico è stata eseguita misurando la perossidazione lipidica e l’attività degli enzimi antiossidanti. Il livello di TBARS nel gruppo Rett è risultato essere significativamente superiore (p<0.001) rispetto a quanto misurato nel gruppo di controllo.

Inoltre due isoforme di Metallotioneine (MT1A e MT2A) risultano significativamente più espresse nel gruppo Rett rispetto al gruppo di controllo.

Correlazioni significative sono anche emerse fra alcuni parametri clinici misurati con le scale Kerr e CSS e il livello di MT1A, TBARS e Catalasi.

Per quanto riguarda la correlazione fra lo stress ossidativo e il profilo di metilazione genica, non è stato evidenziato nessun locus genico con epimutazioni significative correlabile con la sindrome di Rett e lo stress ossidativo.

 

Conclusioni

Nel nostro studio le bambine RTT presentano una condizione di stress ossidativo (quantificato in termini di incremento della perossidazione lipidica negli eritrociti) superiore rispetto alle bambine di controllo. Inoltre le bambine RTT hanno livelli di espressione di MT1A e MT-2A significativamente superiori ai controlli. Viene quindi confermato che le metallotioneine e MT-1A in particolare, rappresentino un marker di stress ossidativo nella sindrome di Rett, rilevabile a livello ematico. Non è stata invece evidenziata nessuna correlazione fra il profilo di metilazione e lo stress ossidativo.

Inoltre sono state identificate correlazioni specifiche fra alcuni parametri clinici misurati con le scale Kerr e CSS e il livello di stress ossidativo. Questo potrebbe consentire un utilizzo più mirato di approcci terapeutici basati sulla modulazione dello stress ossidativo e aprire la strada a studi di efficacia che tengano in considerazione i parametri clinici più coinvolti.

 

 

Bibliografia:

Battisti C, Formichi P, Tripodi SA, Meloni I, Mangiavacchi P, Zappella M, Federico A. Lymphoblastoid cell lines of Rett syndrome patients exposed to oxidative-stress-induced apoptosis. Brain Dev. 2004 Sep;26(6):384-8.

Bebbington A, Anderson A, Ravine D, Fyfe S, Pineda M, de Klerk N, Ben-Zeev B, Yatawara N, Percy A, Kaufmann WE, Leonard H. Investigating genotype-phenotype relationships in Rett syndrome using an international data set. Neurology. 2008 Mar 11;70(11):868-75.

Chomczynski, P. and Sacchi, N. (1987). Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry, 162,156-159.

Coyle, P., Philcox, J.C., Carey, L.C., Rofe, A.M. (2002). Metallothionein: the multipurpose protein. Cellular Molecular Life Science, 59,627-637.

De Felice C, Ciccoli L, Leoncini S, Signorini C, Rossi M, Vannuccini L, Guazzi G, Latini G, Comporti M, Valacchi G, Hayek J. Systemic oxidative stress in classic Rett syndrome. Free Radic Biol Med. 2009 Aug 15;47(4):440-8.

De Felice C, Signorini C, Durand T, Oger C, Guy A, Bultel-Poncé V, Galano JM, Ciccoli L, Leoncini S, D’Esposito M, Filosa S, Pecorelli A, Valacchi G, Hayek J. F2-dihomo-isoprostanes as potential early biomarkers of lipid oxidative damage in Rett syndrome. J Lipid Res. 2011 Dec;52(12):2287-97

De Felice C, Signorini C, Leoncini S, Pecorelli A, Durand T, Valacchi G, Ciccoli L, Hayek J. The role of oxidative stress in Rett syndrome: an overview. Ann N Y Acad Sci. 2012 Jul;1259:121-35.

Giunti D., B. Parodi, C. Usai, L. Vergani, S. Casazza, S. Bruzzone, G. Mancardi, A.Uccelli “Mesenchymal Stem Cells Shape Microglia Effector Functions Through the Release of CX3CL1” Stem Cells Sep;30(9), pp. 2044-53, 2012

Iguchi H, Kojo S, Ikeda M.Lipid peroxidation and disintegration of the cell membrane. J Appl Toxicol 1993 13, 269,

James, S.J., Cutler, P., Melnyk, S., et al. (2004). Metabolic biomarkers of increased oxidative stress and impaired methylation capacity in children with autism. American Journal of Clinical Nutrition, 80,1611-1617.

Lanza, C., Morando, S., Voci, A., et al. (2009). Neuroprotective mesenchymal stem cells are endowed with a potent antioxidant effect in vivo. Journal Neurochemistry, 110,1674-1684.

Neul JL, Fang P, Barrish J, Lane J, Caeg EB, Smith EO, Zoghbi H, Percy A, Glaze DG. Specific mutations in methyl-CpG-binding protein 2 confer different severity in Rett syndrome. Neurology. 2008 Apr 15;70(16):1313-21.

Penkowa, M., Sorensen, B.L,, Nielsen, S.L., Hansen, P.B. (2009). Metallothionein as a useful marker in Hodgkin lymphoma subclassification. Leukemia and Lymphoma, 50,200-210.

Russo S, Marchi M, Cogliati F, Bonati MT, Pintaudi M, Veneselli E, Saletti V, Balestrini M, Ben-Zeev B, Larizza L. Novel mutations in the CDKL5 gene, predicted effects and associated phenotypes. Neurogenetics. 2009 Jul;10(3):241-50.

Scala E, Longo I, Ottimo F, Speciale C, Sampieri K, Katzaki E, Artuso R, Mencarelli MA, D’Ambrogio T, Vonella G, Zappella M, Hayek G, Battaglia A, Mari F, Renieri A, Ariani F.MECP2 deletions and genotype-phenotype correlation in Rett syndrome. Am J Med Genet A. 2007 Dec 1;143A(23):2775-84

Sierra C, Vilaseca MA, Brandi N, Artuch R, Mira A, Nieto M, Pineda M.Oxidative stress in Rett syndrome. Brain Dev. 2001 Dec;23 Suppl 1:S236-9.

A. Uccelli, M. Milanese, MC. Principato, S. Morando, Bonifacino T., L. Vergani, D. Giunti, A. Voci, E. Carminati, F. Giribaldi, C. Caponnetto and GB Bonanno “Intravenous Mesenchymal Stem Cells Improve Survival and Motor Function in Experimental Amyotrophic Lateral Sclerosis” Molecular Medicine, Jul 18;18, pp.794-80 2012

Uchida, Y., Takio, K., Titani, K., Ihara, Y., Tomonaga, M. (1991). The growth inhibitory factor that is deficient in the Alzheimer’s disease brain is a 68 amino acid metallothionein-like protein. Neuron, 7,337-347.

Vergani L, Grattarola M, Borghi C, Dondero F, Viarengo A.Fish and molluscan metallothioneins. FEBS J. 2005 Dec;272(23):6014-2

Vergani L., Lanza C., Borghi C., Scarabelli L., Panfoli I., Burlando B., Viarengo A., Gallo G. “Effects of growth hormone and cadmium on the transcription regulation of two metallothionein isoforms” Molecular and Cellular Endocrinology 2007 Jan,15;263(1-2), 29-37

Vergani L. “Metallothioneins in aquatic organisms: fish, crustaceans, molluscs and echinoderms” in Metal ions in life sciences Vol 5 (eds A. Sigel, H. Sigel, and R.K.O. Sigel), Royal Society of Chemistry Publishing, Cambridge, UK, ISSN 1559-0836, 199-233 2009

Vergani L., Lanza C, Rivaro P, Abelmoschi M, Genti S, Veneselli E, Minniti G, Grasselli E, Canesi L, Voci A “Metals, metallothioneins and oxidative stress in blood of autistic children” Research in Autism Spectrum Disorders 2011

I commenti sono chiusi.