Il gene MECP2, localizzato sul cromosoma X, è mutato nel 95% dei pazienti affetti dalla Sindrome di Rett, una grave malattia del neurosviluppo che rappresenta una delle principali cause di disabilità intellettiva in individui di sesso femminile. L’ablazione del gene MECP2 in tutti i tessuti del topo o la sua distruzione esclusivamente nel cervello causano una malattia che ricapitola molti aspetti della Sindrome di Rett, evidenza che sottolinea l’importanza della funzione della proteina MeCP2, codificata da tale gene, a livello cerebrale.
Sin dalla sua identificazione, avvenuta nel lontano 1992, il numero delle funzioni biologiche ascritte alla proteina MeCP2 è in continua crescita. Il suo ruolo principale consiste nel silenziamento dell’espressione di numerosi geni attraverso un meccanismo epigenetico, che prevede il legame di specifici segmenti di DNA modificati chimicamente (DNA metilato) e il reclutamento di altre proteine con funzione di repressori. Tuttavia, alcuni anni fa è stata dimostrata anche la capacità di MeCP2 di promuovere l’espressione di alcuni geni in specifici distretti del cervello, attraverso il reclutamento di proteine con funzione di attivatori. Attualmente, due principali isoforme della proteina MeCP2 sono state caratterizzate, indicate come MeCP2A e MeCP2B. Entrambe le isoforme sono espresse nel cervello, anche se MeCP2B è notevolmente più abbondante e sembra essere l’isoforma principalmente coinvolta nell’insorgenza della Sindrome di Rett.
Studi effettuati in cellule di topo hanno evidenziato che MeCP2 è importante non solo per la regolazione dell’espressione di numerosi geni, ma sembra essere coinvolta anche nella regolazione globale del genoma. Nelle singole cellule MeCP2 si accumula, infatti, a livello di regioni cromosomiche vicine ai centromeri, composte da proteine peculiari e DNA ripetitivo (DNA del satellite maggiore) non codificante per proteine. Fino a qualche anno fa, il DNA ripetitivo era definito “DNA spazzatura” (junk DNA) e ad esso non era attribuita alcuna funzione. Tale ipotesi è stata poi confutata ed oggi si ritiene che tali regioni del genoma siano importanti per diversi fenomeni, come il corretto impacchettamento dei cromosomi nel nucleo. Queste regioni cromosomiche formano la cosiddetta eterocromatina pericentromerica e sembrano essere coinvolte nella formazione di compartimenti repressivi nel nucleo (domini silenti) a livello dei quali sembrerebbero posizionarsi quei geni che in una determinata condizione biologica devono essere silenziati. Il meccanismo di funzionamento, il ruolo dei domini di eterocromatina silente ed il contributo di MeCP2 in tali processi non è stato ancora completamente chiarito.
Negli anni precedenti, abbiamo dimostrato che MeCP2 svolge una funzione chiave nella ri-organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica durante il differenziamento neurale di cellule staminali embrionali di topo (Bertulat, De Bonis, Della Ragione et al, 2012, PloS One). Qualche anno più tardi, abbiamo dimostrato che in questo processo biologico, MeCP2 è coadiuvato dalla proteina ATRX, a sua volta mutata nella sindrome da alfa-talassemia e ritardo mentale legati al cromosoma X (ATR-X). Nello stesso lavoro si riporta, inoltre, che MeCP2 e ATRX regolano reciprocamente la loro espressione e il loro posizionamento a livello dell’eterocromatina pericentromerica, e che entrambe hanno un ruolo nella regolazione dell’espressione di alcune proteine tipiche di queste regioni cromosomiche (Marano et al, 2019, Int. J. Mol. Sci).
Con il lavoro pubblicato nel 2020 (Fioriniello et al, 2020, Stem Cell Reports), abbiamo caratterizzato a fondo il meccanismo molecolare attraverso il quale MeCP2 regola l’organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica nei neuroni, evidenziando il contributo di un RNA non codificante per proteine, definito MajSat-fw RNA, a sua volta trascritto dall’eterocromatina pericentromerica. Abbiamo, inoltre, messo in luce quale delle due isoforme di MeCP2 partecipa a tale fenomeno biologico e quale porzione della proteina è coinvolta. Infine, abbiamo analizzato l’effetto di due mutazioni di MeCP2 frequenti nelle pazienti Rett, in tale fenomeno.
Mediante l’utilizzo combinato di modelli cellulari di topo in cui è stata indotta l’ablazione del gene MeCP2 o il silenziamento del MajSat-fw RNA, abbiamo, in prima istanza, dimostrato che MeCP2 e il MajSat-fw RNA sono reciprocamente dipendenti per il loro posizionamento all’eterocromatina pericentromerica nei neuroni e che le due molecole interagiscono fisicamente tra loro a livello di tali regioni genomiche. Si è osservato, inoltre, che in assenza di MeCP2 vi è un’errata organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica, poichè l’accumulo delle due proteine istoniche H3K9me3 e H4K20me3, tipiche di queste porzioni di genoma, è significativamente ridotto.
Successivamente, la generazione di cellule staminali embrionali di topo esprimenti selettivamente le isoforme MeCP2A o MeCP2B, ha consentito di stabilire che l’isoforma MeCP2B gioca un ruolo predominante rispetto all’isoforma MeCP2A nella ri-organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica durante il differenziamento neurale e nel corretto reclutamento del MajSatfw RNA a livello di tali regioni cromosomiche. Uno studio analogo, effettuato con cellule esprimenti selettivamente l’isoforma MeCP2B priva della porzione della proteina che lega il DNA metilato (dominio di legame del DNA metilato) o priva della porzione utile per la repressione dell’espressione genica (dominio di repressione trascrizionale), ha evidenziato che il dominio di legame del DNA metilato è cruciale per la ri-organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica e che MeCP2 necessita di entrambi i domini per reclutare correttamente il MajSat-fw RNA a livello di tali regioni cromosomiche.
Infine, mediante l’utilizzo di due linee cellulari staminali embrionali di topo, portatrici di due delle più comuni mutazioni nella proteina MeCP2 riscontrate nelle pazienti Rett, R306C e T158M, abbiamo messo in luce la rilevanza dell’aminoacido T158, e non di quello R306, sia per la riorganizzazione dell’eterocromatina pericentromerica durante il differenziamento neurale sia per il corretto reclutamento del MajSat-fw RNA a livello di queste regioni genomiche, in accordo con la maggiore gravità dei sintomi clinici nelle pazienti portatrici della mutazione T158M.
I risultati ottenuti in questo lavoro sottolineano l’importanza della proteina MeCP2 nella regolazione dell’architettura della cromatina nei neuroni e chiariscono il meccanismo molecolare sottostante, evidenziando per la prima volta il contributo di un RNA non codificante in tale processo biologico.
In conclusione, tali dati consentono di ipotizzare che i difetti nell’organizzazione dell’eterocromatina pericentromerica, causati da alterazioni nella proteina MeCP2, possano essere responsabili di un’errata localizzazione di specifici geni rispetto ai domini di eterocromatina silente. Simili eventi potrebbero causare un’inappropriata espressione di tali geni che potrebbe, a sua volta, contribuire alla patogenesi della Sindrome di Rett. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire la correlazione tra alterazioni dell’architettura nucleare ed il fenotipo patologico della Sindrome di Rett