Un’estesa relazione sul razionale dell’utilizzo terapeutico di questa molecola, che si basa sulla stimolazione farmacologica dei processi di plasticità cerebrale e il recupero funzionale in un modello validato della sindrome, è riportata nel numero di Vivirett del convegno di Trento. (Per quanto riguarda le ricerche già svolte vedi articolo dott.ssa De Filippis e dott. Laviola). I risultati molto promettenti, illustrati dalla dott.ssa Bianca De Filippis, Sezione di Neuroscienze Comportamentali dell’Istituto Superiore di Sanità, Roma, indicano l’efficacia del trattamento in vivo con questa molecola. In particolare, appaiono ripristinate le capacità motorie e cognitive, e contrastate alcune alterazioni molecolari a livello cerebrale.
Successivamente, la dott.ssa Marcella Vacca, ricercatore presso il laboratorio del dott. D’Esposito (Institute of Genetics and Biophysics “A. Buzzati Traverso Napoli) che ha illustrato i risultati di un recentissimo studio eseguito su neuroni di cervelli di embrione al 15° giorno disezionati da un modello animale di topo per la sindrome, Mecp2-/y. A differenza dell’epoca postnatale, periodo di insorgenza dei sinto-
mi della patologia, per il quale vi sono molti studi eseguiti sul modello animale, i dati sugli eventi neuronali in epoca prenatale sono stati poco indagati. Gli studi del gruppo di D’Esposito dimostrano che le diramazioni dendritiche dei neuroni ottenuti dal cervello del topo Mecp2-nullo sono meno complesse di quelle osservabili nelle cellule ottenute dai topi selvatici e che l’assenza di MECP2 incide sul livello di espressione di circa 500 geni. Attivando mediante l’uso di LP-211, lo specifico recettore della serotonina 5HT7, con trattamento in vitro di colture primarie di corteccia embrionale (da topo Mecp2-nullo e da linea selvatica) si ottiene una reversione del fenotipo morfologico (ossia un incremento nel numero di sinapsi e di ramificazioni), un recupero della trascrizione del 30% di geni, a livelli fisiologici di espressione. Analisi bioinformatiche hanno indirizzato la loro ricerca verso specifiche “vie molecolari” che potrebbero spiegare il difetto morfologico osservato in questa finestra temporale dello sviluppo e su cui il farmaco potrebbe avere un favorevole impatto. Oltre a supportare l’effetto terapeutico dell’agonista di 5HT7, in linea con i risultati prodotti in vivo dal gruppo dell’ISS di Roma a inizio 2014, l’importanza di questa ricerca consiste nella dimostrazione che alcune alterazioni morfologiche e molecolari, a carico di neuroni di corteccia cerebrale del topo Mecp2-nullo, si riscontrino già nel periodo embrionale e soprattutto che esse possano essere farmacologicamente recuperate.
Un altro importante risultato, eseguito su tutte e tre le molecole, è lo studio degli effetti sinaptici del trattamento, appena iniziato dal dott Pizzorusso, mediante la metodica della microscopia a due fotoni in vivo che permette di seguire le sinapsi in vivo giorno dopo giorno. La prima fase prevedeva uno studio preliminare, sugli effetti delle tre molecole prima nel topo normale, necessario in quanto nessuna di queste sostanze era stata testata a livello sinaptico nel topo. Successivamente è stato possibile passare ad uno studio degli effetti sul modello patologico.

Per quanto riguarda LP211 i dati sono ancora molto preliminari, anche se sono stati raccolti dei campioni ed inviati al gruppo di D’Esposito che permetteranno di avere una valutazione trascrittomica di come varia la trascrizione genica nella corteccia cerebrale nei modelli MeCP2 e quali siano gli effetti dell’agonista 5HT7.

L’utilizzo di questa molecola a scopo terapeutico ha il suo razionale nelle ricerche del dott. Giustetto e dott. Pizzorusso che hanno evidenziato come un deficit di sintesi proteica possa essere alla base
dei sintomi associati alla Sindrome di Rett e sia conseguente ad un difetto nella via di segnalazione che controlla la via intracellulare di mTOR (mammalian target of rapamycin). Infatti, l’attività di mTOR, oltre a controllare la sintesi di nuove proteine, regola le dimensioni e la forma dei neuroni, così come la morfologia ed il funzionamento delle sinapsi, alterati nella sindrome di Rett. Inoltre, studi recenti hanno dimostrato che alterazioni della via di segnalazione di mTOR sono coinvolte in molte altre gravi patologie neurologiche dello sviluppo accompagnate da ritardo mentale grave come il Fragile-X, la sclerosi tuberosa e la sindrome di PhelanMcDermid. Questo dato è particolarmente interessante in quanto indica che la via di segnalazione di mTOR è un processo chiave per il corretto funzionamento dei circuiti nervosi e che cure efficaci contro il suo malfunzionamento potrebbero essere utili non solo alle bambine Rett ma anche in altre neuropatologie. La dott.ssa Eleonora Calcagno, ricercatrice nel laboratorio del dott. Giustetto, ha riportato un aggiornamento sugli studi di un composto farmacologico sperimentale (un inibitore della fosfatasi PTEN) in grado di riattivare la via di segnalazione di mTOR e quindi la sintesi proteica deficitaria nei topolini Rett. Dai risultati finora ottenuti emerge che già poche ore dopo un singolo trattamento con questo composto i topolini Rett mostrano livelli metabolici normali per mTOR nel cervello e che con un trattamento farmacologico acuto si correggano alcuni importanti deficit comportamentali quali difetti motori, esplorativi e cognitivi e si reverta il fenotipo ansiogeno tipico della RTT. Infine, un risultato promettente seppure preliminare indica che il trattamento cronico con questa sostanza è in grado di determinare nel modello animale un miglioramento a lungo termine dei difetti motori. Analisi mediante pulsossimetria dei parametri vitali autonomici, quali frequenza respiratoria e cardiaca, non ha rivelato particolari effetti avversi del trattamento farmacologico ad esclusione di un lieve effetto bradicardico.
È in corso inoltre la valutazione dell’effetto della molecola sulle alterazioni neuronali e molecolari tipiche della RTT, mediante una analisi di parametri neurologici come la morfologia dei neuroni e dei contatti sinaptici (sede dello scambio delle informazioni nervose), che sembra dimostrare una potenziale efficacia anche per tali aspetti. Si inseriscono in questo contesto anche gli studi del dott. Pizzorusso che dimostrano che l’inibitore di PTEN stabilizza le spine dendritiche e promuove la crescita di nuove spine.
Infine, in collaborazione con la dott. ssa I. Meloni e la prof.ssa A. Renieri dell’Università di Siena, si sta valutando l’effetto dell’inibizione di PTEN su cellule neuronali umane derivate da cellule staminali pluripotenti riprogrammate direttamente dai pazienti. I risultati di questo studio incrociato Torino-Siena rappresentano un passo decisivo per questo progetto poiché saranno in grado di rivelare se l’approccio farmacologico finora sviluppato in modelli animali, sarà in grado di essere efficace anche nell’uomo ovvero svelerà quali modifiche ai protocolli saranno necessarie.
In conclusione, i risultati ottenuti finora indicano che l’attivazione della via di segnalazione di mTOR può portare giovamento nel topolino Rett migliorandone i fenotipi comportamentali e i danni neurologici.

Recentemente si è iniziato uno studio per verificare se le potenzialità del D-JNKI1 come neuroprotettore fossero estendibili anche alla patologia della sindrome di Rett; questo peptide è già passato agli studi di clinica III in patologie diverse ma con comuni meccanismi neurodegenerativi.
L’idea di studiare le potenzialità terapeutiche (dott.ssa Borsello, Istituto Mario Negri) di questo peptide nella sindrome di Rett si è basata su alcuni presupposti:
a) la sindrome di RTT può essere definita come una sinaptopatia, in quanto nell’analisi della morfologia dei dendriti nei modelli animali è stata osservata una riduzione regione-specifica nel numero e nella lunghezza sia dei dendriti sia delle spine dendritiche e sono stati identificati alcuni meccanismi molecolari responsabili dei deficit funzionali e di maturazione delle sinapsi;
b) un’importante via di segnale nella sinaptopatia è quella mediata da JNK, sebbene ad oggi non ci siano dati che dimostrino il coinvolgimento di questa chinasi nella sindrome di Rett;
c) JNK, proteina chiave nella disfunzione delle sinapsi eccitatorie, da studi di biologia computazionale era predetta interagire con una certa rilevanza con MECP2;
d) il peptide D-JNKI1, che è già stato oggetto di sperimentazione per altre patologie, una delle quali è una sinaptopatia, ha raggiunto lo stadio di trial clinico 3 per una di esse, inoltre è in grado di attraversare la barriera ematoencefalica e non manifesta tossicità a dosi terapeutiche.
L’attività di ricerca si propone due principali obiettivi: 1) approfondire i meccanismi molecolari alla base della sinaptopatia nella sindrome di Rett ed il ruolo di JNK utilizzando sia modelli murini di questa patologia sia modelli cellulari umani e 2) testare il peptide cellula-permeabile D-JNKI1, con un trattamento in acuto e in cronico, al fine di valutarne l’effetto in vivo e nello stesso tempo comprendere, in maniera più approfondita, gli eventi patologici che conducono alla sinaptopatologia.
Per determinare la sinaptopatologia nella sindrome di Rett il gruppo della dott.ssa Borsello in collaborazione con il dott. Giustetto ha utilizzato il modello murino Mecp2 Jaenisch, con l’espressione della mutazione sul gene coinvolto nella patologia in eterozigosi (Mecp2+/-) e in emizigosi (Mecp2-/y), e analizzato diverse aree cerebrali (corteccia, ippocampo e cervelletto). I campioni sono stati processati con la tecnica TIF (Triton Insoluble Fractionation), ottenendo in questo modo una frazione arricchita in proteine presenti nella densità post-sinaptica (PSD, regione nella quale sono ancorati tutti i recettori), e successivamente analizzati mediante western blot per valutare i livelli di espressione delle proteine della PSD. La minor quantità di queste proteine o markers sinaptici indica un deterioramento della sinapsi (degenerazione sinaptica o sinaptopatologia).
L’analisi delle proteine della corteccia cerebrale di femmine eterozigoti, modello rappresentativo del mosaicismo osservato nelle pazienti, mostra una significativa attivazione di JNK in quest’area cerebrale, che correla con la riduzione dei diversi marker post-sinaptici (subunità dei recettori NMDA e AMPA) rispetto alle femmine controllo. I dati preliminari ottenuti dall’analisi dei campioni delle femmine eterozigoti mostrano che questo potrebbe essere il modello adatto agli studi pre-clinici col peptide inibitore di JNK (D-JNKI1).
Pertanto nel laboratorio del dott. Giustetto, la dott.ssa Eleonora Calcagno ha condotto i primi esperimenti di comportamento sul modello murino Mecp2 Jaenisch per verificare se l’inibizione specifica di JNK potesse avere un effetto terapeutico nella sindrome di Rett. Femmine eterozigote e controllo di 4 mesi sono state trattate con il peptide e 48 ore dopo testate all’open field e al rotarod per valutarne le capacità esplorative e motorie. Quest’ultimo test è stato ripetuto settimanalmente nelle successive 3 settimane. Data la stabilità in vivo del peptide, il trattamento è stato ripetuto dopo 3 settimane dalla prima iniezione. Anche in questo caso, dopo 48h gli animali sono stati sottoposti al rotarod seguendo lo stesso schema descritto precedentemente. Al termine dell’esperimento è stata effettuata l’analisi biochimica dei marker post-sinaptici in diverse aree cerebrali (ippocampo, corteccia e cervelletto).
Gli studi comportamentali hanno messo in evidenza le differenze basali tra topi controllo e mutanti e i dati dimostrano che in seguito al trattamento con D-JNKI1 le capacità motorie ed esplorative vengono ripristinate. Sugli stessi animali l’analisi Western blot mostra una significativa riduzione, in tutte le aree cerebrali considerate, delle subunità NR2A e NR2B dei recettori NMDA, così come di quelle GluR1 e GluR2 dei recettori AMPA e della proteina strutturale PSD95. Le femmine eterozigoti trattate con D-JNKI1 mostrano un recupero del deficit sinaptico a livello cerebellare e l’espressione della proteina PSD95, fortemente ridotta in quelle non trattate, viene ripristinata ai livelli confrontabili con quelli degli animali wild-type. D-JNKI1 conferisce quindi un recupero dei markers sinaptici a livello cerebellare; questi risultati acquisiscono ancora maggior forza con i dati comportamentali che confermano il recupero delle spine dendritiche.
Al fine di studiare le interazioni tra MeCP2 e JNK in un modello cellulare umano, la dott.ssa Russo ha mostrato i risultati di esperimenti su linee cellulari umane, cellule SKNBE(2)-c ed SHSY5Y (derivate da neuroblastomi umani), molto utilizzate negli studi di malattie neurologiche perché in grado di esprimere proteine neuronali. Le linee cellulari sono state transfettate con vettori che portavano una copia funzionante di MECP2 e con vettori che portavano una copia di MECP2 con mutazioni presenti nelle pazienti R168X, R255X ed R270X. Si voleva verificare se la presenza della mutazione in MeCP2 alterasse l’espressione della proteina JNK, bersaglio del peptide terapeutico, e quindi che MeCP2 regolasse l’espressione di JNK, proteina. Gli esperimenti hanno escluso questa ipotesi. Al fine di capire se nel modello cellulare umano ci fosse comunque un’interazione, diretta o indiretta, tra le due molecole che potesse giustificare una loro relazione, sono stati eseguiti in un diverso modello cellulare HECT293, anch’esso in grado di esprimere molecole neuronali umane, esperimenti di cotrasfezione in immunofluorescenza di entrambi i vettori MeCP2 e JNK, sia con MECP2 mutato, sia wild type per capire se le due molecole occupassero lo stesso comparto cellulare e se ci fosse una differenza tra cellule con mutazione e cellule normali. In parallelo sono stati eseguiti sulle stesse cellule esperimenti di co-immunoprecipitazione per verificare un’interazione tra le due molecole. Gli esperimenti per ora preliminari dimostrerebbero un’interazione tra le due molecole nella linea normale ed una maggiore interazione tra MeCP2 e JNK nel nucleo così l’ipotesi che nel modello cellulare umano il deficit di MeCP2 crei una disfunzione nella funzione di JNK.
Infine gli studi del dott. Pizzorusso hanno dimostrato una grande efficacia di D-JNK-1 nello stabilizzare le spine dendritiche e nel promuovere la crescita di nuove spine.

La professoressa Renieri ha relazionato su alcuni dati ottenuti grazie al modello cellulare umano di precursori neuronali e di neuroni da fibroblasti di pazienti con mutazione MECP2 (e anche CDKL5 e FOXG1), che risultano in accordo con quanto discusso dalla dott.ssa Vacca sul modello murino. Tali neuroni sono stati ottenuti revertendo geneticamente i fibroblasti a cellule staminali indotte (iPS) e differenziandole successivamente in precursori neuronali o neuroni. L’analisi con marcatori delle sinapsi eccitatorie e inibitorie ha mostrato uno sbilanciamento globale a favore di un aumento dell’attività inibitoria e diminuzione di quella eccitatoria nei pazienti rispetto ai controlli. Si ritiene che i neuroni ottenuti da iPS corrispondano in vivo a neuroni molto giovani, addirittura a quelli presenti nel feto. Questi dati dimostrano pertanto che sebbene la malattia si manifesti a distanza di mesi dopo la nascita in realtà le anomalie a livello delle sinapsi neuronali sono preesistenti alla nascita. Inoltre, questi dati dimostrano che è possibile utilizzare questo modello per testare molecole a fini terapeutici monitorizzando il ripristino dello sbilanciamento eccitatorio/inibitorio presente in questo tipo di neuroni “artificiali” derivanti direttamente dalle pazienti e di queste completamente rappresentativi per identità di genoma.

Infine il dott. Invernizzi e la prof.ssa Renieri hanno proposto un nuovo progetto che prende spunto da uno studio sperimentale pubblicato lo scorso anno sulla prestigiosa rivista Nature Genetics implicava un difetto del metabolismo del colesterolo cerebrale nella sindrome di Rett. Secondo gli autori, un’eccessiva sintesi endogena di colesterolo, un componente essenziale delle membrane delle cellule nervose e precursore di importanti ormoni, potrebbe contribuire ad alcuni sintomi mostrati dai topi portatori di mutazioni del gene Mecp2, il cui omologo umano è notoriamente mutato nella gran parte delle pazienti. Nel topo mutato, i deficit motori, erano parzialmente corretti dalla somministrazione di statine, quei farmaci largamente utilizzati in terapia per tenere sotto controllo le ipercolesterolemie. Stimolati da questi risultati, i gruppi dell’Airett Research Team dell’Istituto “Mario Negri” di Milano e dell’Università di Siena e U.O.C. di Genetica Medica coordinati rispettivamente dal dott. Invernizzi e dalla prof. Renieri hanno iniziato ad elaborare una strategia che possa contribuire a chiarire la rilevanza clinica di questi interessanti risultati. L’intenzione dei ricercatori è di muoversi lungo due direzioni: innanzitutto confermare l’attività delle statine nel ridurre i deficit nel topo e usare il modello animale per individuare un biomarcatore in grado di indicare attraverso un semplice prelievo del sangue la presenza di alterazioni del metabolismo cerebrale del colesterolo nel topo portatore di mutazione Mecp2. A questo punto, lo stesso biomarcatore potrà essere misurato nel sangue delle pazienti e in un gruppo di soggetti sani dello stesso genere ed età per individuare se e in che proporzione il metabolismo del colesterolo cerebrale sia alterato nella sindrome di Rett. In caso affermativo si procederà a valutare gli effetti di un trattamento con statine, farmaco in commercio e pianificare un trial clinico per valutarne l’effettiva efficacia. Il trial verrà condotto sulle bambine italiane di pari passo ad un analogo trial in fase di preparazione negli USA. I due trial faranno da validazione l’uno dell’altro ovvero eventuali risultati se replicati nei 2 studi acquisiranno una valenza scientifica più forte. Lo studio è in fase di elaborazione e potrà procedere con il supporto di altri ricercatori e centri clinici e il necessario sostegno finanziario.