F4- Neuroprostani plasmatici e relazione genotipo-fenotipo nella Sindrome di Rett

Sintesi della presentazione del dott. C. De Felice al “2nd European Rett Syndrome Conference Edinburgh”, Edimburgo 7-10 Ottobre 2010

Claudio De Felice(1), Cinzia Signorini(2), Silvia Leoncini(2), Giuseppe Valacchi(3,4), Lucia Ciccoli(2) e Joussef Hayek(5)

1Unità di Terapia Intensiva Neonatale, Policlinico “Le Scotte” Azienda Ospedaliera Universitaria Senese, Siena, Italia

2Dipartimento di Fisiopatologia, Medicina Sperimentale e Sanità Pubblica, Università degli Studi di Siena, Siena, Italia

3Dipartimento di Scienze Biomediche, Università degli Studi di Siena, Siena, Italia

4Department of Food and Nutrition, Kyung Hee University, Seoul, Korea

5Child Neuropsychiatry Unit, University Hospital AOUS, Siena, Italia

il-dott-claudio-de-feliceIl dott. Claudio De Felice il-dott-joussef-hayekIl dott. Joussef Hayek

 

Background

Dal 2009 il nostro gruppo di ricerca multidisciplinare ha formulato l’ipotesi ipossico-ossidativa nella sindrome di Rett [1,2].

Lo stress ossidativo (SO) è una condizione patologica causata da uno sbilanciamento tra un’eccessiva produzione di radicali liberi (specie chimiche ossidanti) e la loro eliminazione da parte di sistemi di difesa antiossidante. Anche se i radicali liberi svolgono un ruolo fisiologico nel sistema immunitario, uccisione dei batteri patogeni, e come segnali di comunicazione cellulare, un eccesso di radicali liberi è implicato in varie patologie umane [3].

In letteratura alcuni autori avevano già immaginato la presenza di anomalie dello SO in pazienti con sindrome di Rett [4,5]. Le metodologie utilizzate e/o i markers valutati, in questo tipo di ricerche, non erano però molto attendibili o affidabili. Nel 2006 il gruppo del prof. Bird aveva osservato anomalie mitocondriali in un modello animale della malattia (topo MeCp2 nullo, MeCp2 y/-) [6], che, insieme alla dimostrazione ultrastrutturale di anomalie mitocondriali in biopsie di pelle e muscolo da pazienti affette dalla sindrome di Rett [7] potevano suggerire una anomalia dello SO nella Rett.

Gli isoprostani sono una famiglia di lipidi biologicamente attivi recentemente identificata come una nuova classe di indici specifici e affidabili di perossidazione lipidica e di danno ossidativo in vivo e ex vivo. Queste molecole sono stabili, relativamente abbondanti e misurabili mediante tecniche analitiche sensibili. La determinazione dei livelli di isoprostani nei tessuti e nei liquidi biologici ha significativamente migliorato la nostra conoscenza sul ruolo svolto dallo stress ossidativo in molte patologie neurologiche.

La prima dimostrazione certa della presenza di SO generalizzato nella sindrome di Rett è giunta solo nel 2009 con la dimostrazione dell’aumento degli F2-Isoprostani, prodotti di perossidazione dell’acido arachidonico (componente essenziale delle membrane cellulari), nel sangue (plasma) di pazienti con sindrome di Rett, correlata alla dimostrazione della presenza di una ipossia cronica e alterati scambi polmonari dell’ossigeno in pazienti con la forma classica della malattia [1].

Lo studio attuale

Gli F4-Neuroprostani (F4-NeuroPs) [Tabella 1] sono considerati importanti marker di SO della membrana dei neuroni [8,9]. Gli F4-NeuroPs derivano da reazioni di ossidazione di tipo non enzimatico a carico dell’acido Docosaesanoico (DHA), uno degli acidi grassi polinsaturi (PUFA) omega 3 a lunga catena. Il DHA è contenuto nelle membrane cellulari, in particolar modo in quelle delle cellule neuronali e svolge un ruolo importante nella funzionalità delle membrane eccitabili [Tabella 2] [10]. Un aumento dei livelli degli F4-NeuroPs plasmatici indica la presenza di un danno ossidativo della sostanza grigia cerebrale.

Tabella 1 – Principali markers di stress ossidativo

Markers di Stress ossidativo Significato biologico
Ferro libero intraeritrocitario (NPBI) Indicatore di uno stato pro-ossidante, maggiore suscettibilità al danno ossidativo.Indicatore di ipossia
Ferro libero plasmatico (NPBI) Indicatore di uno stato pro-ossidante, maggiore suscettibilità al danno ossidativo
F2-Isoprostani (F2-IsoPs) Indicatore di danno ossidativo lipidico (deriv. da Ac.Arachidonico, AA)
F3-Isoprostani (F3-IsoPs) Indicatore di danno ossidativo lipidico (deriv. da Ac. Eicosapentenoico, EPA).
F4-Neuroprostani (F4-NeuroPs) Danno ossidativo delle membrane neuronali (sostanza grigia) (deriv. da Ac. Docosaesanoico, DHA)
F2-Dihomo-Isoprostani (F2-DH-IsoPs) Danno ossidativo delle membrane gliali (sostanza bianca (deriv. da Ac. Adrenico, AdA))
Carbonili Proteici Danno ossidativo delle proteine
Addotti Proteici del 4-idrossinonenale (4-HNE) Danno ossidativo delle proteine
8-deossiguanosina (8OHdG) Danno ossidativo del DNA

 

Tabella 2 – Isoprostani e cervello dei primati

Unicità del cervello dei primati in termini di pufa
Principali PUFA nel cervello dei primati
DHA(Ac. Docosaesanoico) AdA(Ac. Adrenico) AA(Ac. Arachidonico)
Classif. chimica 22:6 3 22:4 6 20:4 6
Localizzazione anatomica1 Assoni neuronali(s. bianca), corpi cellulari e dendriti

(s. grigia)

Mielina(s. bianca) Distribuzione uniforme
Corrispondenti prodotti di ossidazione F4-NeuroPs F2-di-homo-Ps F2-IsoPs
Metodologia di misura dei prodotti di perossidazione GC/NICI/MS GC/NICI/MS GC/NICI/MSGC/NICI/MS/MS

LC/MS

ELISA

Potenziale applicazione diagnostica dei prodotti di ossidazione Patologia SO-mediata specifica della membrana neuronale Patologia SO-mediata specifica della mielina Sofferenza cerebrale SO-mediata aspecifica

Fino ad ora nessun gruppo di ricerca è riuscito a misurare in modo efficiente i livelli di F4-NeuroPs nel sangue (plasma). Il nostro team ha applicato una nuova metodica GC-NICI associata alla spettrometria di massa, altamente sensibile [11], che ha permesso di valutare i livelli di tali composti nel plasma. L’analisi delle mutazioni delle pazienti è stata ricavata dalla biobanca dell’Università di Siena (“Cell Lines and DNA Bank of Rett syndrome and other X mental retardation” Prof. A. Renieri, Unità di Genetica Medica) [12].

I nostri risultati in 83 pazienti con sindrome di Rett e mutazione del gene MeCp2 hanno evidenziato livelli di F4-Neuroprostani plasmatici circa 9 volte più elevati nelle pazienti con sindrome di Rett rispetto ai valori misurati su un gruppo di soggetti controllo, comparabile per età e sesso. Abbiamo anche dimostrato che pazienti con mutazioni puntiformi del MeCp2 associate generalmente al fenotipo più severo (R270X, R255X, R168X) presentano valori di F4-NeuroPs plasmatici più elevati rispetto alle pazienti con mutazioni MeCp2 associate con fenotipo più lieve (delezioni C-terminali, R294X, R133C) In particolare, il nostro studio indica che i livelli plasmatici degli F4-NeuroPs sono in grado di spiegare oltre il 90% della variabilità fenotipica delle forme di s. di Rett legate a mutazione del MeCP2 (forma classica e forma a linguaggio conservato) (articolo in corso di pubblicazione).

La determinazione degli F4-NeuroPs plasmatici ha quindi confermato l’importanza e la validità dell’ipotesi ipossico-ossidativa nella patogenesi della sindrome di Rett. Aumentati livelli di F4-NeuroPs sono stati misurati anche in altre patologie neurologiche, quali Alzheimer (in modello sperimentale), Parkinson (in modello sperimentale e nell’uomo) ed emorragia sub-aracnoidea (in liquor) [13-15].

Ulteriori studi sono in corso per valutare la “storia naturale ossidativa” della malattia Rett vista dal punto di vista degli F4-NeuroPs. Attualmente sono in corso anche indagini sulla ricerca di nuovi markers di SO nelle pazienti Rett e studi intesi a verificare i dati degli F4-NeuroPs anche su 2 modelli sperimentali della malattia (topo MeCp2 nullo e mutato).

Dedica

Questo lavoro è dedicato al cantante professionista Matteo Setti il cui incontro casuale ha stimolato l’interesse del Dott. De Felice e di sua figlia Laura nei confronti del mondo delle emozioni suscitate dal canto e dalla musica nelle “bimbe dagli occhi belli”. Infatti, già da alcuni anni la voce calda e potente di Matteo è al servizio della ricerca scientifica sulla sindrome di Rett.

 

Lo studio “in pillole”

Cosa sono gli F4-Neuroprostani (F4-NeuroPs)?

Gli F4-Neuroprostani (F4-NeuroPs) sono una particolare famiglia di isoprostani e rappresentano degli indicatori (marker) fedeli di danno ossidativo della membrana delle cellule nervose (neuroni).

Perché misurare gli F4-Neuroprostani nel plasma delle pazienti con sindrome di Rett?

Il nostro gruppo di ricerca aveva già dimostrato nel 2009 la presenza di un eccessivo livello di stress ossidativo in pazienti con s. di Rett. Lo studio attuale indica per la prima volta che lo stress ossidativo nella s. di Rett avviene anche nel sistema nervoso centrale delle pazienti affette.

Quali sono i livelli medi di F4-Neuroprostani nella popolazione “normale” e nella sindrome di Rett?

Nella popolazione normale il livello medio di F4-NeuroPs nel plasma è inferiore o uguale ad 1 pg/ml, mentre nelle pazienti con sindrome di Rett il valore medio è intorno a 9 pg/ml (con valori che in alcuni casi superano 40-50 pg/ml).

Cosa aggiungono di nuovo gli F4-Neuroprostani a quanto già noto nella sindrome di Rett?

Il nostro studio dimostra che il livello di F4-NeuroPs nel plasma delle pazienti riflette il grado di gravità clinica (fenotipo) e delle mutazioni del MeCp2 (genotipo), per lo meno nella s. di Rett correlata a mutazioni del MeCP2, vale a dire circa il 90-95% di tutti i casi clinici della malattia. Questi dati indicano che gli F4-NeuroPs sono i probabili mediatori biochimici della gravità fenotipica della malattia.

Quali nuove prospettive aprono gli F4-Neuroprostani nella sindrome di Rett?

La scoperta che gli F4-NeuroPs sono nuovo marker biochimico correlato alla sindrome di Rett 1) apre potenzialmente la strada alla possibilità di eseguire una diagnosi più precoce della malattia, addirittura in fase pre-sintomatica; 2) getta nuova luce sui meccanismi alla base del percorso che dalla mutazione conduce all’espressione fenotipica della malattia ed infine 3) consente in un futuro prossimo la ricerca di nuove strategie terapeutiche per la sindrome di Rett.

 

BIBLIOGRAFIA ESSENZIALE

  1. De Felice C, Ciccoli L, Leoncini S, Signorini C, Rossi M, Vannuccini L, Guazzi G, Latini G, Comporti M, Valacchi G, Hayek J. Systemic oxidative stress in classic Rett syndrome. Free Radic Biol Med. 2009;47:440-8.
  2. Pecorelli A, Ciccoli L, Signorini C, Leoncini S, Giardini A, D’Esposito M, Filosa S, Hayek J, De Felice C, Valacchi G. Increased levels of 4HNE-protein plasma adducts in Rett syndrome. Clin Biochem. 2011;44:368-71.
  3. Halliwell B, Gutteridge JMC. Free radicals, other reactive species and disease. In: Halliwell B, Gutteridge JMC, editors. Free radicals in biology and medicine. Oxford, Clarendon Press, 1999:617-783
  4. Sierra C, Vilaseca MA, Brandi N, et al.. Oxidative stress in Rett syndrome. Brain Dev 2001;23:236-239
  5. Haas RH, Nasirian F, Hua X, Nakano K, Hennessy M. Oxidative metabolism in Rett syndrome: 2. Biochemical and molecular studies. Neuropediatrics 1995; 6:95-99
  6. Kriaucionis S, Paterson A, Curtis J, Guy J, Macleod N, Bird A. Gene expression analysis exposes mitochondrial abnormalities in a mouse model of Rett syndrome. Mol Cell Biol 2006; 26:5033-5042
  7. Cardaioli E, Dotti MT, Hayek G, Zappella M, Federico A. Studies on mitochondrial pathogenesis of Rett syndrome: ultrastructural data from skin and muscle biopsies and mutational analysis at mtDNA nucleotides 10463 and 2835. J Submicrosc Cytol Pathol 1999; 31:301-304
  8. Roberts LJ 2nd, Montine TJ, Markesbery WR, Tapper AR, Hardy P, Chemtob S, Dettbarn WD, Morrow JD. Formation of isoprostane-like compounds (neuroprostanes) in vivo from docosahexaenoic acid. J Biol Chem. 1998;273:13605-12.
  9. Taber DF, Roberts LJ II. Nomenclature systems for the neuroprostanes and for the neurofurans. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2005; 78:14-18
  10. Soderberg M, Edlund C, Kristensson K, Dallner G. Fatty acid composition of brain phospholipids in aging and in Alzheimer’s disease. Lipids 1991; 26:421−425
  11. Signorini C, Ciccoli L, Leoncini S, et al. Free iron, total F2-isoprostanes and total F4– neuroprostanes in a model of neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy: neuroprotective effect of melatonin. J Pineal Res 2009; 46:148-154
  12. Sampieri K, Meloni I, Scala E, Ariani F, Caselli R, Pescucci C, Longo I, Artuso R, Bruttini M, Mencarelli MA, Speciale C, Causarano V, Hayek G, Zappella M, Renieri A and Mari F (2007). Italian Rett database and biobank. Hum Mutat 28(4):329-35.
  13. Montine TJ, Quinn J.F, Milatovic D, et al. Peripheral F2-isoprostanes and F4-neuroprostanes are not increased in Alzheimer’s disease. Ann Neurol 2002; 52:175-179
  14. Seet RC, Lee CY, Lim EC, et al. Oxidative damage in Parkinson disease: Measurement using accurate biomarkers. Free Radic Biol Med 2010; 48:560-566.
  15. Hsieh YP, Lin CL, Shiue AL, Yin H, Morrow JD, Hsu JC, Hsieh TC, Wei HJ, YenHC. Correlation of F4-neuroprostanes levels in cerebrospinal fluid with outcome of aneurysmal subarachnoid hemorrhage in humans. Free Radic Biol Med. 2009;47:814-24.

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