Resoconto progetti AIR 2008-2010

Progetto n. 1

Studio delle differenze genetiche tra la forma classica e la variante a linguaggio conservato della Sindrome di Rett al fine di delineare strategie terapeutiche volte ad un miglioramento della sintomatologia.

Progetto concluso

La relazione finale di questo studio è stata riportata nel numero 55 di ViviRett alla pagina 10.

 

Progetto n. 2

Caratterizzazione dei meccanismi genetici ed epigenetici che rappresentano elementi causativi e/o modificativi della Sindrome di Rett al fine di ottimizzare un iter diagnostico riabilitativo e delineare strategie terapeutiche volte ad un miglioramento della sintomatologia.

Relazione Dott.ssa Silvia Russo - Responsabile progetto Istituto Auxologico Milano.

Progetto in corso

Un primo obiettivo del progetto cofinanziatoci dal comune di Milano si proponeva di identificare un percorso diagnostico che consentisse di abbassare l’età della diagnosi nelle bambine con sospetta sindrome di Rett e di studiare la correlazione tra difetto genetico e manifestazioni cliniche. A tale proposito è stato elaborato un questionario per la raccolta di informazioni cliniche per definire la presenza dei criteri principali e di supporto, l’eventuale tipo di forma atipica (ad epilessia precoce, congenita, a linguaggio preservato) ed il grado di severità con cui si esprimono i sintomi principali e quelli di supporto. La compilazione delle schede è tuttora in corso e, soprattutto per le pazienti che restano senza un riscontro nell’identificazione del difetto genetico, il ritorno dei dati clinici è limitato ad un numero esiguo di pazienti. Tuttavia la valutazione dei risultati ottenuti concordi con i dati della letteratura, sono stati la base per proporre l’applicazione di un protocollo di analisi dei difetti genetici, che seguisse un iter diverso secondo la diagnosi clinica. In presenza di un fenotipo clinico inquadrabile come Rett classica, l’indagine viene avviata con il sequenziamento ed eventuale successiva analisi delle duplicazioni/delezioni del gene MECP2, nei casi invece ove la patologia si manifesti con un esordio precoce dell’epilessia (entro i primi 3-6 mesi vita) il primo gene analizzato è stato CDKL5. La scelta di FOXG1 come primo gene è limitata ai casi segnalati come encefalopatia precoce, senza il manifestarsi del classico periodo di regressione.

Attualmente presso il nostro laboratorio sono state conseguite diagnosi genetiche in 121/551 pazienti per il gene MECP2, e 14/165 per il gene CDKL5, mentre nessuna variazione è stata identificata in 50 pazienti analizzati per FOXG1. In 37 pazienti con epilessia precoce è stata applicata la flow-chart invertita. Di particolare interesse l’osservazione che 4/14 pazienti con difetto di CDKL5 presentano delezioni estese ad uno o più esoni del gene, identificabili mediante l’applicazione della metodica MLPA, che deve assolutamente essere introdotta a completamento nell’iter diagnostico per lo studio di entrambi i geni. Seppure all’interno di ciascun gruppo si osserva una discreta variabilità nella severità delle manifestazioni principali e nell’età di insorgenza della regressione, si possono tuttavia osservare alcune tendenze. Le pazienti con delezioni C-ter mostrano prevalentemente un quadro atipico con espressione più lieve dei sintomi e fra queste 7/9 delle p. Pro389X rientrano nella classificazione di variante a linguaggio preservato. Inoltre sono state identificate due pazienti a linguaggio preservato con fenotipo decisamente lieve e presenza di rare stereotipie sulla linea mediana: entrambe portano mutazioni associate secondo letteratura a manifestazioni meno gravi della sindrome e in una di queste è stato possibile dimostrare la preferenziale espressione dell’allele normale rispetto al mutato dovuta ad un’inattivazione sbilanciata del cromosoma X. Ciò suggerisce di rivalutare i parametri clinici suggestivi per lo studio genetico di sospetta sindrome di Rett estendendola anche a casi di ritardo non grave in pazienti femmine.

Un ulteriore obiettivo si proponeva di definire parametri clinici suggestivi per lo studio genetico di sospetta sindrome di Rett nei maschi. A tale scopo sono stati sequenziati per il gene MECP2 31 pazienti maschi, identificando un solo paziente positivo caratterizzato dalla presenza di una mutazione C-ter, che presentava però un fenotipo classico della sindrome. Ciò suggerisce che il fenotipo di pazienti maschi con mutazioni nel gene MECP2 è molto eterogeneo e solo in pochi casi riconducibile al quadro classico delle pazienti femmine. Le mutazioni più frequenti in queste ultime sono presumibilmente letali in emizigosi.

Infine sempre nell’ambito di tale progetto è stata analizzato il ruolo di specifiche differenze epigenetiche (variazioni nella metilazione del DNA, ma non nella sequenza che influenzano l’attivazione/silenziamento dei geni) potessero avere un effetto modificatore sull’espressione clinica sono stati recentemente effettuati esperimenti di ‘methylation array’ sull’intero genoma (dati non pubblicati). Lo studio, riportato al convegno nazionale di AIR dello scorso anno, ha evidenziato una distribuzione che ordinava le pazienti secondo la severità clinica, a partire dai controlli fino alle pazienti portatrici di mutazioni troncanti precoci, separando anche pazienti con la stessa mutazione. Tale risultato seppure preliminare è suggestivo del fatto che differenze epigenetiche possano modulare l’espressione del fenotipo.

 

Progetto n. 3

Protocollo Sindrome di Rett per l’adolescenza ed età adulta.

Progetto concluso

La relazione finale di questo studio è stata riportata nel numero 56 di ViviRett alla pagina 31.

Conclusioni

I dati ottenuti da questo studio hanno permesso di descrivere le caratteristiche fisiche, comportamentali e psichiche di una popolazione di pazienti italiana, composta da adolescenti ed adulti affetti da S. di Rett; in particolare è emerso che l’epilessia tende a migliorare durante l’età adulta, mentre i problemi gastrointestinali rimangono frequentemente stabili e quelli muscolo-scheletrici tendono a peggiorare. La conoscenza delle condizioni di salute nella S. di Rett in età adulta risulta indispensabile per una migliore e corretta “presa incarico” delle pazienti.

Questi dati preliminari verranno ora elaborati statisticamente, ricercando anche eventuali correlazioni genotipo-fenotipo.

 

Progetto n. 4

Sindrome di Rett: approccio ai disturbi nutrizionali e gastroenterici. Progetto concluso Relazione finale riportata nel numero 57 di ViviRett alla pagina 18.

Conclusioni

Questo studio ha rilevato come nelle bambine affette da Sindrome di Rett sia necessaria una valutazione periodica dello stato nutrizionale e dei disturbi gastrointestinali per dare avvio a programmi e strategie personalizzati; nella maggior parte dei casi questo approccio permette di garantire loro una migliore qualità di vita.

 

Progetto n. 5

L’epilessia nella Sindrome di Rett.

Progetto concluso

Relazione finale riportata nel numero 56 di ViviRett pag. 15.

Conclusioni

In sintesi, da questo lavoro emerge che l’epilessia presenta un’incidenza sulle bimbe affette da RTT di circa l’80% e che nel 30% dei casi è farmacoresistente.

Nella maggior parte delle pazienti le crisi esordiscono fra i 2 e i 5 anni. In una piccola percentuale di casi l’esordio avviene dopo i dieci anni e, in questi casi, le crisi sono sporadiche e farmacoresponsive nell’80% dei casi.

Le forme Hanefeld e PSV si trovano agli estremi del range per la gravità dell’epilessia: nelle prime essa è sempre presente, ha un esordio precoce ed è spesso farmacoresistente, nelle seconde ha una bassa incidenza, esordisce tardivamente ed è nella maggior parte dei casi farmacoresponsiva.

Rispetto ai dati genetici, le delezioni C terminali appaiono correlarsi, più che altre mutazioni, ad una relativa benignità epilettologica. Tra i farmaci più usati la lamotrigina è risultata essere il farmaco più efficace, seguita da carbamazepina e valproato, mentre il fenobarbital è risultato il meno efficace.

Questo studio policentrico ha portato ad una più approfondita conoscenza delle caratteristiche dell’epilessia nella Sindrome di Rett. In particolare fornisce un supporto ai clinici sia nella comunicazione precoce della possibile evoluzione dell’epilessia ai familiari, sia nella pianificazione individualizzata dell’intervento, mirato al miglior controllo clinico delle crisi. Il lavoro è in corso di pubblicazione sulla rivista Epilepsy&Behavior.

 

Progetto n. 6

Costruzione di un quaderno multimediale per la comunicazione nella Sindrome di Rett.

Progetto concluso

Il software completo con il programma multimediale di potenziamento cognitivo nella Sindrome di Rett sarà presentato a Genova in occasione del nostro convegno annuale che si terrà a Genova il prossimo 11 e 12 giugno, una demo è già da qualche mese scaricabile dal nostro sito Internet www.airett.it.

 

Progetto n. 7

Progetto di Formazione e collaborazione con il dottor Lotan Meir del Centro Rett Israeliano e un team italiano sulla riabilitazione nella Sindrome di Rett.

Progetto concluso

Questo progetto di formazione si è concluso ed ha contribuito a realizzare il primo day hospital riabilitativo presso il centro Don Calabria ampiamente descritto nel n. 57 di ViviRett, sul nostro sito www.airett.it e illustrato anche in questo numero.

 

Progetto n. 8

Caratterizzazione della prestazione motoria in pazienti affette da Sindrome di Rett e valutazione dell’efficacia di nuovi strumenti ortesici per la deambulazione e postura.

Attualmente questo progetto non è ancora avviato, ma pensiamo di finanziare una ricerca con queste finalità in applicazione al bando 2011 che l’Air ha indetto nello scorso febbraio dove era prevista anche la presentazione di progetti di ricerca per valutare e studiare le prestazioni motorie nella Rett. In occasione del nostro convegno del prossimo 11/12 giugno verranno illustrati i progetti vincitori del suddetto bando ed auspichiamo di poterne finanziare uno di questo tipo.

 

Progetto n. 9

Produzione di cellule neuronali da fibroblasti riprogrammati di pazienti con Sindrome di Rett: una tecnologia innovativa per testare strategie terapeutiche.

Progetto in corso

Alessandra Renieri, Professore Ordinario di Genetica Medica - Università degli Studi di Siena.

Nel 2007 è stata messa a punto una tecnologia rivoluzionaria, detta riprogrammazione genetica, che consente di creare in provetta cellule analoghe alle cellule staminali embrionali a partire da biopsie cutanee. Queste cellule, dette iPSCs (iPSCs=induced Pluripotent Stem cells = cellule staminali pluripotenti indotte) sono geneticamente identiche all’individuo da cui sono stati ottenuti i fibroblasti e possono essere fatte differenziare in diversi tipi cellulari, inclusi i neuroni. Questo rappresenta un passo avanti enorme per lo studio delle malattie neurologiche come la sindrome di Rett, perché consente di studiare in provetta lo sviluppo delle cellule del cervello, che rappresentano il bersaglio primario della malattia.

Nel 2009 AIR ha finanziato un progetto che mirava a mettere a punto questa innovativa tecnologia anche nel nostro laboratorio a Siena. è per noi un piacere poter presentare adesso i primi risultati di questo lavoro. Per imparare la tecnologia un membro del nostro gruppo, la dottoressa Ilaria Meloni, ha trascorso otto mesi in Canada, presso il prestigioso Sick Children Hospital di Toronto, tornando in Italia con le prime cellule riprogrammate. Dopo gli inevitabili problemi iniziali, dovuti ad alcuni piccoli aggiustamenti della procedura, finalmente siamo potuti partire con gli esperimenti di riprogrammazione sulle nostre pazienti con mutazione in MECP2 (ne abbiamo raccolte 10 e stiamo ancora raccogliendo campioni; per aderire al progetto contattare la dott.ssa Mencarelli Maria Antonietta: mencarelli.ma@unisi.it). Nel frattempo stiamo lavorando anche allo step successivo: il differenziamento delle iPSCs in neuroni. Esistono già delle procedure per ottenere specifici tipi di neuroni a partire dalle staminali embrionali, e alcuni recenti lavori dimostrano che possono essere applicate anche alle iPSCs. Si tratta di un processo lungo, che richiede più di due mesi per ottenere dei neuroni maturi ed è importante verificarne il corretto svolgimento per essere sicuri che i neuroni ottenuti siano quelli voluti e che quindi, qualunque informazione si ricavi da queste cellule, sia pertinente alla malattia. Partendo da iPSCs di MECP2 e CDKL5 abbiamo quindi testato il metodo più comunemente utilizzato e abbiamo seguito il processo di formazione dei neuroni. Come vedete dalle immagini, i primi dati confermano che siamo riusciti a produrre dei neuroni in vitro dalle iPSCs delle nostre pazienti! Stiamo adesso completando le analisi per confermare che si tratti effettivamente del tipo di neuroni che ci interessano e mettendo a punto dei metodi che ci consentiranno di analizzare le singole cellule al fine di effettuare una analisi approfondita. Queste indagini saranno di importanza fondamentale anche per la valutazione di potenziali strategie terapeutiche. Su queste cellule sarà infatti possibile andare a testare l’efficacia e monitorare la potenziale tossicità di nuovi farmaci così da selezionare su un sistema umano i farmaci più promettenti.

 

Progetto n. 10

Presa in carico riabilitativa nella Sindrome di Rett e prima ipotesi di progetto di valutazione riabilitativa mirata, follow up e formazione.

Progetto in corso

Questo progetto è partito grazie ad un importante finanziamento della Fondazione Mariani.

Per il momento prevede la presa in carico per due anni di 36 bambine provenienti da tutta Italia; sono programmati tre corsi di formazione annuali per medici, terapisti da effettuarsi uno a Milano e due in altre regioni d’Italia.

Ci aspetta un grosso impegno finalizzato a dare continuità al progetto anche dopo i primi due anni supportati dal finanziamento della Fondazione Mariani, in modo tale da poter coinvolgere gradualmente tutte le nostre bimbe, affiancando a questo servizio di presa in carico un importante progetto di ricerca sugli aspetti motori.

 

Progetto n. 11

I disturbi del sonno nella Sindrome di Rett: uno studio clinico - Polisonnografico.

Progetto non ancora avviato.

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Lo sviluppo dei progetti conferma la coerenza della “mission” dell’AIR: “

(...) volersi occupare del presente e del futuro delle bimbe/ragazze con Sindrome di Rett”.

Da alcuni di essi abbiamo già una ricaduta assistenziale sulle nostre ragazze - cfr. il day hospital riabilitativo, il software multimediale sul potenziamento cognitivo - da altri, avendo approfondito le problematiche cliniche, c’è ora un miglior approccio assistenziale. Con lo scguardo rivolto al futuro abbiamo due importanti progetti di ricerca di base in corso. Per quanto riguarda il progetto sulle cellule staminali mi ha molto emozionato vedere la foto della pagina precedente che riporta la rete di neuroni che sono stati prodotti dal prelievo di tessuto cutaneo delle nostre bimbe. Il prossimo 12 giugno a Genova, durante l’assemblea AIR, presenteremo i tre progetti che saranno scelti in base alle indicazioni che ci perverranno dal gruppo di revisori nominati per le valutazioni dei numerosi progetti pervenuti in applicazione al primo bando AIR, scaduto il 15 marzo scorso, ricordo che per tale bando la nostra associazione ha destinato 190.000 mila euro. Confidiamo di continuare ogni anno a proporre questi bandi per stimolare la ricerca sulla Sindrome di Rett volta a migliorare le quotidiane condizioni di vita per le nostre ragazze e giungere in un futuro alla loro guarigione.

Lucia Dovigo