I nuovi progetti AIRETT 2011

Lucia Dovigo - Presidente AIRETT

Di seguito elenchiamo i cinque progetti di studio e ricerca finanziati da AIRETT per un totale di € 275.000.

Come già illustrato nel precedente numero di ViviRett, lo scorso febbraio avevamo proposto un bando per il quale ci sono stati sottoposti numerosi progetti: ce ne compiaciamo e cogliamo l’occasione per ringraziare tutti i ricercatori che hanno aderito.

Quattro di questi progetti sono stati scelti sulla base del miglior punteggio ottenuto grazie alla valutazione scientifica fatta da un comitato di revisori esterno all’associazione e da una valutazione di indirizzo espressa dal Consiglio Direttivo dell’associazione.

Tali progetti sono stati presentati dai proponenti ai nostri associati durante l’assemblea dello scorso giugno a Genova; sempre in quell’occasione si è proceduto inoltre alla firma dei contratti di Finanziamento.

A nome mio, di tutti gli associati, ma soprattutto delle nostre ragazze, desidero inviare un sentito ringraziamento alla Signora per la grande generosità e sensibilità dimostrata verso la nostra causa.

Per concludere, desidero ringraziare il Comitato Revisori per il lavoro svolto nel valutare i progetti, e tutti quanti si sono prodigati nella raccolta fondi per rendere possibile questo bando.

 

 

Progetto n. 1

Studio dell’azione moderatrice del complesso ENA/VASP sul difetto sinaptico indotto da mutazioni di MeCP2 in neuroni di topo e ottenuti da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da pazienti.

Proponente:

Tommaso Pizzorusso Istituto Neuroscienze CNR, Pisa

Gruppi partecipanti:

Alessandra Renieri e Ilaria Meloni Unità Operativa di Genetica Medica, Dipartimento di Biotecnologie, Università degli Studi di Siena
Maurizio Giustetto e Noemi Morello National Institute of Neuroscience-Italy e Dipartimento Anatomia, Farmacologia e Medicina Legale, Università di Torino.

 

 

BREVE SINTESI DEL PROGETTO:

L’ipotesi centrale che si tende valutare con questo progetto è che i meccanismi che regolano la polimerizzazione dell’actina dipendenti dalle proteine della famiglia ENA/VASP siano in grado di modulare gli effetti della mutazione di MeCP2.

Nel caso di risultati positivi, si potrebbe successivamente indagare se un fenomeno simile avviene anche con la mutazione CDKL5.

Questa ipotesi verrà studiata valutando in primo luogo se la mutazione di MeCP2 alteri l’espressione e la corretta localizzazione dell’actina e di una batteria di fattori legati alla polimerizzazione dell’actina.

Lo studio sarà effettuato in vivo nei topi con delezione di MeCP2, in colture neuronali murine con ridotta espressione di MeCP2 (knockdown), in linfoblasti ottenuti da banche di tessuti, ed in cellule con mutazione in MECP2 ottenute riprogrammando fibroblasti di pazienti in iPSC da differenziare poi in neuroni. In secondo luogo si valuterà se, come suggerito dagli studi genetici, variazioni dell’espressione della proteina ENA (ortologo murino di ENAH) possano modulare il fenotipo in cellule con mutazioni per MeCP2. In particolare, lo studio verificherà se un aumento o una diminuzione dei livelli di ENA in neuroni in coltura ottenuti da topi con delezione di MeCP2 o iPSC derivanti dai pazienti, possa modulare negativamente o positivamente le alterazioni sinaptiche indotte dalle mutazioni in MeCP2. L’analisi delle sinapsi verrà effettuata sia con tecniche morfologiche (visualizzazione delle spine dendritiche ed imaging della loro motilità, immunocitochimica per marcatori dei terminali pre e postsinaptici), che funzionali (registrazioni elettrofisiologiche delle correnti sinaptiche dai neuroni in coltura).

La molteplicità di approcci necessari per lo svolgimento del progetto è garantita dalla differenziazione dei centri coinvolti. Il laboratorio di Pisa (Prof. Pizzorusso), che fungerà da coordinatore, ha esperienza nello studio elettrofisiologico e di imaging delle spine dendritiche; inoltre ospita una colonia di topi con delezione di MeCP2 (modello Jaenisch). Il laboratorio di Siena (Prof.ssa Renieri) ha identificato la duplicazione del gene ENAH nella bambina con Z-RTT e proseguirà gli studi genetici su questi aspetti; inoltre la Prof.ssa Renieri dirige la biobanca Italiana RTT (www.sienabiobanknetwork.org) a cui verranno richieste le linee cellulari linfoblastoidi e i fibroblasti primari necessari per la produzione delle iPSC. L’unità di Siena valuterà l’espressione dei fattori associati al rimodellamento dell’actina in queste cellule e fornirà le iPSCs alle altre unità del progetto. Il laboratorio di Torino (Prof. Giustetto) ha grande esperienza nello studio dell’organizzazione delle sinapsi mediante microscopia confocale ed elettronica. Il suo ruolo sarà di valutare mediante analisi immunoistochimiche la localizzazione subcellulare delle proteine del citoscheletro actinico; si occuperà inoltre dell’analisi morfologica e molecolare delle sinapsi in vivo e nei preparati in vitro precedentemente descritti. Tutte e tre le unità hanno un’ampia precedente esperienza in studi sulla sindrome di Rett documentata da pubblicazioni, svolte in parte in collaborazione, di alto impatto su riviste internazionali. La Prof.ssa Renieri ed il Prof. Pizzorusso collaborano con l’AIRETT facendo parte del suo consiglio scientifico. Se il concetto alla base di questo progetto venisse provato, i risultati ottenuti sarebbero di grande importanza per la RTT in quanto permetterebbero l’identificazione di nuove vie biochimiche alterate a causa della mutazione di MeCP2. I fattori coinvolti in tali alterazioni potrebbero quindi fungere da bersagli molecolari di possibili terapie farmacologiche. Inoltre, l’analisi di alterazioni in questi fattori potrebbe contribuire alla comprensione dei meccanismi genetici capaci di modificare il quadro clinico delle bambine affette. Infine, la riprogrammazione di fibroblasti ottenuti da pazienti in iPSC ed il loro differenziamento in cellule neuronali costituisce un valore aggiunto in quanto lo studio delle alterazioni sinaptiche presenti in tale modello potrebbe validarlo per lo screening di trattamenti mirati al miglioramento di questi difetti indotti dalle mutazioni di MeCP2 in cellule di pazienti.

 

Progetto n. 2

Alterazione dei meccanismi dello stress ossidativo e loro trattamento in un modello animale della sindrome di Rett

Proponente

Maurizio D’Esposito Istituto di Genetica e Biofisica “A.Buzzati Traverso”, CNR, Napoli

Gruppi partecipanti

Giovanni Laviola Istituto Superiore di Sanità, Roma
Joussef Hayek Azienda Ospedaliera Universitaria Senese, AOUS.

 

 

BREVE SINTESI DEL PROGETTO

Questo progetto prende spunto da una serie di risultati preliminari ottenuti dal gruppo proponente:

1. Si è stabilita una relazione univoca tra mutazioni del gene, severità del fenotipo e i livelli di alcuni marcatori dello SO, quali F2 ed F4 isoprostani e del ferro non legato a proteine (NPBI) nel plasma di pazienti RTT. I livelli di F2 ed F4 isoprostani e di NPBI sono marcatori della perossidazione lipidica, che a sua volta indica la presenza di SO (Esterbauer et al., 1991; Buonocore et al., 2003; Milne et al., 2008).
2. Il trattamento con acidi grassi a lunga catena, come la miscela di acido docosaesanoico/eicosapentanoico (DHA-EPA) eseguito da uno dei gruppi partecipanti al progetto (Dott. Y. Hayek, Policlinico Le Scotte, Siena) su 21 pazienti RTT per 6 mesi ha rivelato significativi miglioramenti nei parametri clinici, valutati utilizzando le scale di Kerr e Percy.
3. La relazione tra alterazioni patologiche di MECP2 e livello dei marcatori di SO è conservata in due riconosciuti modelli murini per la sindrome di Rett. Nel plasma e nel cervello di topi nulli Mecp2 -/y (Guy et al., 2001) e nel cervello del modello portatore di una mutazione troncante Mecp2-308/y (Shahbazian et al., 2002) il livello di F2 ed F4 isoprostani e NPBI è significativamente alterato.

Con questo progetto ci si propone di studiare gli effetti, molecolari e comportamentali, della somministrazione della miscela DHA-EPA nel modello murino nullo. Il trattamento delle pazienti con DHA-EPA, che sarà continuato ed eseguito su un numero maggiore di pazienti grazie a finanziamenti specifici già destinati al gruppo del Policlinico di Siena, potrà contribuire solo in parte alla comprensione del meccanismo d’azione di tali acidi grassi sui pathway molecolari e sul comportamento. Ad esempio, poche informazioni possono essere ottenute circa l’effetto di tale trattamento sulla durata di vita del soggetto trattato, oppure sul periodo di insorgenza dei sintomi. Per tale ragione, grazie all’esperienza nel campo dello studio comportamentale di uno dei gruppi proponenti, verificheremo se il trattamento con DHA-EPA può contrastare le alterazioni comportamentali e motorie precedentemente evidenziate nel modello murino (Ricceri et al., 2008; De Filippis et al., 2010). In parallelo, saranno effettuate una serie di analisi morfologiche e funzionali, quali valutazione del livello plasmatico di leptina, valutazione del livello di BDNF in ippocampo, analisi immunoistochimica di neuroni e cellule della glia a livello di diverse aree cerebrali, nonché la risonanza magnetica (MRI) e spettroscopica (MRS), con o senza trattamento con DHA-EPA.

A livello molecolare, saranno valutati i marcatori di SO ed il livello dei ROS in diversi tessuti, quali plasma, cervello e polmone, tessuti facilmente accessibili nel modello murino sopra indicato, con o senza trattamento con DHA-EPA.

Di recente, la sindrome di Rett è stata associata ad una alterazione nel profilo di espressione di microRNA (Urdinguio et al., 2010; Wu et al., 2010). Alla luce di tale evidenza, saranno analizzati profili di espressione di microRNA mediante ibridazione di microarray specifici, analogamente a quanto già effettuato dal gruppo proponente, per una differente patologia cromatinica (Gatto et al., 2010). Lo studio sarà effettuato in ippocampo, ipotalamo e cervelletto del modello murino MeCP2-/y con o senza trattamento con DHA-EPA.

Tale analisi dovrebbe evidenziare una reversione dei livelli di microRNA in seguito al trattamento con DHA-EPA.

 

Progetto n. 3

Studio dell’eterogeneità clinica in un’ampia coorte di pazienti con sindrome di Rett mediante un approccio biochimico-molecolare.

PROPONENTI:

Silvia Russo Laboratorio di Genetica Molecolare Istituto Auxologico Italiano
Edvige Veneselli U.O. e cattedra Neuropsichiatria Infantile Istituto Gaslini, Università di Genova

COLLABORATORI:

Laura Vergani, Adriana Voci Università di Genova, Dip di Fisiologia e Biofisica Aglaia Vignoli, Francesca La Briola Centro Regionale per l’Epilessia dell’Ospedale San Paolo

 

La Prof.ssa Veneselli, la Dott.ssa Russo e la signora Dovigo al momento della firma per il finanziamento del progetto da parte di AIRETT

 

BREVE SINTESI DEL PROGETTO:

La Sindrome di Rett (RTT, MIM 312750) è un disturbo progressivo dello sviluppo neurologico che presenta un’incidenza di 1:10000 persone di sesso femminile.

Nonostante l’identificazione di tre geni coinvolti (MECP2, CDKL5 e FOXG1), la patogenesi della sindrome non è ad oggi nota.

Lo studio che presentiamo si prefigge di:

1. approfondire le attuali conoscenze di base dei meccanismi patogenetici responsabili della sindrome di Rett;
2. identificare pathways neurologici e biochimici alterati nella sindrome di Rett;
3. identificare fattori modificatori del quadro clinico nei suoi molteplici aspetti al fine di poter indirizzare verso un eventuale trattamento terapeutico della sindrome;
4. identificare nuovi difetti genetici causativi della sindrome.

Tale obiettivi verranno raggiunti tramite la valutazione:

1. di geni differenzialmente espressi in modo significativo in una ampia coorte di pazienti Rett, rappresentativa per tipo di mutazione e fenotipo;
2. di regioni differenzialmente metilate in modo significativo nella stessa coorte;
3. della correlazione del:
   • fenotipo nella sua totalità (scala di severità globale) e differenze significative nell’espressione di geni afferenti a pathway specifici regolati da MeCP2,
   • fenotipo epilettico e differenze significative nell’espressione di geni afferenti a pathway specifici regolati da Mecp2,
   • fenotipo nella sua totalità e differenze significative nella metilazione di regioni del genoma (variazioni epigenetiche),
   • il fenotipo epilettico e differenze significative nella metilazione di regioni del genoma (variazioni epigenetiche);
4. verifica dello stato di stress ossidativo e di eventuali difetti nei livelli di espressione di metallotioneine (MT) a livello ematico;
5. sequenziamento esteso delle pazienti senza difetto genetico (negativo allo screening di MECP2, CDKL5 e FOXG1).

 

Progetto n. 4

Analisi multifattoriale del movimento e del cammino nella sindrome di Rett

PROPONENTE:

Ioannis Ugo Isaias Medico Neurologo, Specialista in disturbi del movimento, Laboratorio per l’Analisi del Movimento nel Bambino P. & L. Mariani – L.A.M.B., Dipartimento di Fisiologia Umana, Università degli Studi di Milano

COLLABORATORI PARTECIPANTI:

Paolo Cavallari Ordinario di Fisologia Umana, Dipartimento di Fisiologia Umana, Laboratorio per l’Analisi del Movimento nel Bambino P. & L. Mariani – L.A.M.B. , Dipartimento di Fisiologia Umana, Università degli Studi di Milano
Carlo Frigo Associato di Biongegneria Meccanica, Politecnico di Milano Jianyi Lin Informatico, Dipartimento di Matematica, Università degli Studi di Milano
Alberto Marzegan Ingegnere, Laboratorio per l’Analisi del Movimento nel Bambino P. & L. Mariani – L.A.M.B. , Dipartimento di Fisiologia Umana, Università degli Studi di Milano
Nardo Nardocci Medico Neurologo Specialista in Neuropsichiatria Infantile, Divisione di Neuropsichiatria Infantile, I.R.C.C.S. “C. BESTA“ Milano
Marina Luisa Rodocanachi Roidi Medico Neurologo e Fisiatra, Istituto Don Calabria Milano.

 

La firma per il finanziamento del progetto da parte del dottor Isaias, della dottoressa Rodocanachi e della Presidente AIRETT, signora Dovigo

 

BREVE SINTESI DEL PROGETTO:

La sindrome di Rett (RTT) è una malattia rara e complessa per la multiproblematicità dei fattori invalidanti. Uno degli aspetti principali e più gravi è la progressiva perdita del controllo locomotorio e del cammino, spesso inficiato dalla presenza di movimenti involontari, distonia, atassia e spasticità.

Soltanto raramente le strategie di trattamento utilizzabili nelle patologie neuromotorie infantili possono essere causali, orientate cioè alla rimozione della noxa patogena alla base della lesione. Nella grande maggioranza dei casi, esse devono invece mirare alla correzione o al contenimento degli effetti prodotti da una serie di meccanismi fisiopatologici, centrali e periferici, che interferiscono con attività e competenze funzionalmente rilevanti.

Un’analisi approfondita del profilo fisiopatologico sotteso al deficit motorio clinicamente osservabile rappresenta dunque in questi casi un elemento essenziale del piano di lavoro dell’équipe incaricata della pianificazione terapeutica. Ad oggi, non sono disponibili in letteratura studi che descrivono in modo preciso le alterazioni del cammino e della postura in bambine con RTT.

In questo contesto, lo studio sperimentale proposto dal Laboratorio per l’Analisi del Movimento nel Bambino P. & L. Mariani – L.A.M.B. (Dipartimento di Fisiologia Umana, Università degli Studi di Milano), si propone di esaminare il pattern locomotorio e la presenza di eventuali fenomeni spastici durante la deambulazione con tecniche cliniche e strumentali non invasive e quantitative, al fine (i) di descrivere le caratteristiche fisiopatologiche della postura e del movimento in bambine con RTT; (ii) di indagare la possibile interferenza di fenomeni spastici durante l’esecuzione di un compito motorio naturale; (iii) di definire l’entità di tale interferenza in termini di severità delle anomalie di reclutamento muscolare e di relativo effetto meccanico; (iv) di caratterizzare la topografia della spasticità dinamica in termini di distribuzione su gruppi muscolari rappresentativi distali degli arti inferiori; (v) di trarre dalle informazioni sopracitate una serie di indicazioni essenziali per la definizione di linee di intervento riabilitativo razionali.

A seconda delle capacità motorie della bambina, la misurazione di parametri cinematici, dinamici ed EMG sarà eseguita nel corso di compiti di tipo posturale (i.e. mantenimento della stazione eretta) e di compiti locomotori (i.e. cammino ed inizio del cammino). La cinematica del movimento sarà analizzata per mezzo di un sistema optoelettronico, il quale consente il calcolo delle coordinate 3D di marcatori riflettenti posti su punti di repere anatomici del corpo. Le bambine dovranno mantenere la postura eretta su una pedana dinamometrica (inserita nel pavimento) e quindi camminare liberamente, se possibile. L’attività elettrica muscolare (EMG) di superficie sarà acquisita per mezzo di un elettromiografo multicanale telemetrico. Non saranno utilizzate procedure invasive (e.g. EMG ad ago). Per l’elaborazione dei dati saranno indispensabili programmi dedicati, alcuni dei quali proprietari ed altri realizzati ad hoc presso il L.A.M.B..

 

Progetto n. 5

Analisi dei geni HLA per valutare la suscettibilità genetica ai vaccini come componente della patogenesi della sindrome di Rett.

PROPONENTE:

Alessandra Renieri Professore ordinario di Genetica Medica, Università degli Studi di Siena e Primario UOC Genetica Medica, Azienda Ospedaliera Universitaria Senese

COLLABORATORI:

Antonio Amoroso Professore ordinario di Genetica Medica, Università degli Studi di Torino e Primario SC Immunologia dei Trapianti, Azienda Ospedale S Giovanni di Torino

BREVE SINTESI DEL PROGETTO:

La fase di regressione acuta (6-12 mesi) della sindrome di Rett coincide con il periodo delle vaccinazioni infantili. Dati che provengono sia dalla nostra esperienza che dalla letteratura indicano che diverse bambine RTT sono state inizialmente classificate come affette da encefalopatia per danno da vaccino (Moeschler JB, et al 1988) (Fiumara A. et al 2002) (A. Renieri, dati non pubblicati). Questi dati sembrano suggerire che la sindrome di Rett sia causata, oltre che dalla mutazione in MECP2, da altri fattori. Portano cioè all’ipotesi che la mutazione in MECP2 sia condizione necessaria ma non sufficiente per lo sviluppo della malattia. In accordo con questa ipotesi, è stato recentemente dimostrato che mutazioni patogenetiche in MECP2 sono state identificate in una percentuale di neonati (circa 3,5%) molto più alta della prevalenza della malattia (inferiore a 1/10.000) (J. Yu, ASHG meeting 2010). Abbiamo quindi ipotizzato che la sindrome di Rett possa svilupparsi solo nei soggetti che presentano la mutazione in MECP2 combinata con la presenza di particolari alleli del sistema HLA. Tale assetto potrebbe indurre una disfunzione del sistema immunitario che potrebbe portare ad un’abnorme risposta nel caso di vaccinazione. In effetti diversi studi in letteratura hanno portato ad attribuire a MECP2 importanti funzioni anche nello sviluppo e nella regolazione del sistema immunitario (Balmer D et al. 2002) (Tong Y et al. 2005) (Lal G et al. 2009) (Webb R et al. 2009) (Plioplys AV et al. 1994) (Fiumara A et al. 1999) (Szabo SJ et al. 2000) (Tanioka T et al. 2005) (Delgado IJ et al. 2006) (Lintas C et al. 2011). L’insieme di questi risultati ha portato ad ipotizzare un’origine immunitaria per la Rett e ad indicare il sistema immunitario come possibile target terapeutico (Derecki NC et al 2010). Ci proponiamo quindi di effettuare la tipizzazione di alcuni geni HLA in un’ampia casistica di pazienti Rett (233 pazienti con mutazione in MECP2) e verificare se la frequenza genica possa deviare significativamente dalla frequenza caratterizzata nella popolazione italiana al fine di stabilire se alcuni geni del sistema HLA possano determinare o influenzare la severità del fenotipo RTT.

FINALITA' DEL PROGETTO:

In questo progetto, proponiamo la caratterizzazione HLA in pazienti mutati in MECP2 allo scopo di:

1. studiare se esista una correlazione con l’insorgenza della sindrome di Rett;
2. verificare se esista una correlazione con la gravità della malattia.

RISULTATI ATTESI:

Con questo progetto ci aspettiamo di:

1. stabilire se i geni del sistema HLA sono coinvolti nell’insorgenza della sindrome di RTT;
2. stabilire se i geni del sistema HLA sono modificatori del fenotipo RTT.

Nel caso in cui una delle due ipotesi sia verificata, ci aspettiamo di poter elaborare potenziali strategie terapeutiche volte a migliorare la sintomatologia RTT tramite intervento mirato sul sistema immunitario.